Microbiome-based analytical approaches and biopreservation agents for improving meat quality and safety

Resumen

La carne fresca y los ambientes de procesado de la carne pueden albergar una amplia variedad de microorganismos. Pueden encontrarse a lo largo de las líneas de procesado, en las materias primas, productos finales y en las superficies en contacto y de no contacto con los alimentos. Cuando los microorganismos se añaden como cultivos iniciadores, son beneficiosos ya que desempeñan funciones importantes, como por ejemplo dirigir procesos de fermentación o competir con microorganismos perjudiciales. Por el contrario, otros microorganismos son alterantes o patógenos, siendo perjudiciales para la calidad y seguridad de los productos cárnicos. En general, el estudio de los microorganismos en la industria alimentaria se ha abordado mediante metodologías basadas en su cultivo en el laboratorio, aunque en los últimos años se han producido nuevos avances y mejoras que han conducido a la aplicación de metodologías más exhaustivas que proporcionan información sobre el microbioma completo de los alimentos. Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS, por sus siglas en inglés) ofrecen ventajas sobre las metodologías clásicas dependientes de cultivo. Sin embargo, en general siguen estando infrautilizadas en la industria alimentaria y, en particular, en el sector cárnico. El objetivo de los tres primeros capítulos experimentales de esta Tesis Doctoral era desarrollar métodos y protocolos basados en HTS para estudiar la composición y función del microbioma de la carne y sus ambientes de procesado asociados. Brevemente, el Capítulo I describe un procedimiento para estudiar el microbioma de los ambientes de procesado de la carne mediante secuenciación del metagenoma completo. Aborda la estrategia de muestreo en la industria y el procedimiento para la extracción de ADN metagenómico total, con un protocolo mejorado para aumentar el rendimiento teniendo en cuenta la baja concentración microbiana que se puede encontrar en las plantas de procesado después de la limpieza y desinfección. El protocolo puede obtener cantidades de ADN superiores a 10 ng en más del 98% de las muestras y permite la obtención de una media de 12,2 genomas ensamblados a partir de metagenomas por muestra, lo que mejora notablemente otras alternativas disponibles. El Capítulo II presenta y discute los resultados obtenidos de la validación del protocolo descrito en el Capítulo I en diecinueve industrias cárnicas para caracterizar las comunidades microbianas que prevalecen específicamente en la carne, los productos cárnicos y sus ambientes de procesado. Se observó que las especies bacterianas pertenecientes a los géneros Pseudomonas, Staphylococcus, Brochothrix, Acinetobacter y Psychrobacter dominaron en todos los tipos de muestras, siendo la especie Pseudomonas fragi y varias del género Psychrobacter las más abundantes en los ambientes de procesado. También se encontró una gran diversidad de presuntas nuevas especies en ambientes de procesado de carne, lo que demuestra la existencia de una importante diversidad microbiana aún por investigar. El Capítulo III se centra en el desarrollo de una metodología mejorada para el estudio de integrones de clase I, basado en la amplificación y secuenciación mediante tecnología de lecturas largas. Su uso para la caracterización del resistoma asociado a estos elementos genéticos en la carne, los productos cárnicos y sus ambientes de procesado permitió la caracterización de integrones de clase I con hasta 7 genes de resistencia a antibióticos diferentes, principalmente relacionados con la resistencia a aminoglicósidos, betalactámicos y antagonistas del folato. Teniendo en cuenta que la carne y los productos cárnicos pueden ser el origen de ciertos patógenos alimentarios vinculados con riesgos para la salud pública y la seguridad alimentaria, urge la necesidad de validar nuevas estrategias de conservación y control de patógenos que sean eficaces en la industria cárnica. Además, la tendencia actual hacia alimentos producidos de forma más natural impulsa la búsqueda de alternativas a los aditivos convencionales. Las bacterias lácticas (BAL) son una buena alternativa como agentes de bioconservación de alimentos por ser generalmente reconocidas como seguras y por su potencial efecto antimicrobiano frente a patógenos de origen alimentario. El objetivo de los tres últimos capítulos de esta Tesis Doctoral era diseñar y validar estrategias de bioconservación basadas en el uso de BAL para mejorar la calidad y seguridad de productos cárnicos. En el Capítulo IV se evalúa la combinación de un cultivo iniciador comercial con altas presiones hidrostáticas (APH) para controlar el crecimiento de Listeria monocytogenes y Salmonella Typhimurium en un embutido fermentado (chorizo de León). La aplicación de HPP en las primeras etapas de maduración, solo o en combinación con el cultivo iniciador, que contenía Pediococcus acidilactici, Latilactobacillus sakei y Staphylococcus carnosus, permitió el control de L. monocytogenes y S. Typhimurium, con reducciones de hasta 4,8 y 2,4 unidades logarítmicas, respectivamente, sin afectar adversamente la calidad físico-química o sensorial. El Capítulo V describe la selección de tres cepas de BAL (Lactococcus lactis, Lacticaseibacillus paracasei y Lactiplantibacillus plantarum), en función de su aptitud como agentes antilisteria en diferentes productos cárnicos, y su posterior evaluación en jamón cocido en combinación con envasado al vacío, envasado en atmósfera modificada y HPP. Por último, el Capítulo VI se centra en el estudio del efecto de las cepas de BAL previamente seleccionadas para controlar L. monocytogenes en carne de cerdo marinada. Los ensayos de desafío realizados en jamón cocido y en carne de cerdo marinada evidenciaron que el cóctel de BAL fue capaz de adaptarse a la matriz alimentaria y dominar sobre el resto de microorganismos durante el almacenamiento, controlando el crecimiento de L. monocytogenes y de algunas bacterias alterantes como Brochothrix, sin efectos adversos notables sobre las características físico-químicas o sensoriales de los productos. En conclusión, los seis capítulos experimentales que forman esta Tesis Doctoral contribuyen a la obtención de productos cárnicos seguros mediante estrategias combinadas de control microbiológico, utilizando metodologías de secuenciación del ADN como herramienta innovadora para estudiar el microbioma de los productos cárnicos y sus ambientes de procesado asociados, y aplicando agentes de bioconservación capaces de modular el microbioma de productos cárnicos.