Incremento de la eficiencia reproductiva de la cría porcina mediante la aplicación de nuevas técnicas avanzadas de análisis de la cromatina espermática y selección por coloide

Resumen

El sector porcino es una pieza clave en la economía española. España es líder europeo en la producción de carne de cerdo y ocupa el segundo puesto a nivel mundial en cuanto a su exportación. Por ello, la industria porcina es muy competitiva en nuestro país, siendo el objetivo producir más y mejor con menos animales criados, reduciendo la presión ambiental en un mercado en el que los costes van en aumento debido a la implementación de mejoras que permiten un seguimiento individualizado de los animales. Por ello, se usan técnicas de reproducción como la inseminación artificial (IA), para reducir el número de animales. Actualmente, el sector porcino se enfrenta a dos grandes retos: el uso de antibióticos las dosis de IA (debido a la contaminación bacteriana de las dosis refrigeradas, que afecta a la fertilidad) y la detección de verracos subfértiles. El uso incontrolado de antibióticos ha generado una de las mayores crisis sanitarias en el mundo actual: la resistencia antimicrobiana. Por ello, se pide un uso controlado de los antibióticos, con fines terapéuticos y solo cuando sean estrictamente necesarios. Para intentar solucionar este problema, esta Tesis propone reemplazar el uso de antibióticos en las dosis de IA utilizando un método físico para eliminar bacterias, mediante coloides y centrifugación. Los coloides comenzaron a usarse con dos capas de gradientes de densidad (DGC) y, posteriormente pasó a utilizarse una centrifugación en una sola capa (SLC), para ahorrar tiempo y dinero. En la SLC en porcino se utiliza el coloide Porcicoll, pero se necesita evaluar si una densidad muy baja del coloide es eficaz para eliminar las bacterias al procesar un gran volumen de eyaculado, y su efecto sobre los espermatozoides, para determinar su utilidad práctica en la industria porcina. Por ello, en los capítulos IV y V se procesó un gran volumen de muestra espermática usando el Porcicoll a una baja concentración (20 % y 30 %, P20 y P30) para evaluar si era eficaz eliminando o reduciendo la contaminación bacteriana. También se evaluó el efecto sobre los espermatozoides, analizando la recuperación, el efecto sobre los parámetros fisiológicos (capítulo IV) y el estado de la cromatina espermática mediante un análisis de correlaciones canónicas (CCA), que permitió estudiar las relaciones entre la microbiología y los parámetros espermáticos (capítulo V). Los resultados son muy prometedores, ya que se consiguió reducir o eliminar todas las bacterias, especialmente con P30. Tanto P20 como P30 favorecieron el mantenimiento de la calidad seminal durante el almacenamiento frente al tratamiento control. Respecto a la cromatina, se observó un incremento de los puentes disulfuro tras el almacenamiento, mejorando la compactación. El uso de CCA demostró ser eficaz para interpretar un gran número de variables simultáneamente. En un estudio subsiguiente (capítulo VI) evaluamos la capacidad de la SLC con P20 y P30 para eliminar bacterias específicas mediante un diseño de spiking con especies bacterianas relevantes. Los resultados corroboraron la eliminación o reducción de la carga bacteriana tras aplicar la SLC, especialmente con P30, y una mejor calidad espermática tras el almacenamiento en las muestras procesadas. Los resultados de este estudio apoyaron los de los capítulos IV y V sobre la aplicabilidad de la SLC en el sector porcino, siendo una opción para procesar muestras de alto valor genético. Por tanto, en la línea de sustitución de antibióticos en las dosis de IA, P30 parece ser una buena opción, con una recuperación espermática aceptable y una reducción muy eficiente de las bacterias, lo que resultó en dosis espermáticas con una calidad mejorada. Este efecto se produjo no sólo por la eliminación bacteriana, sino también por un efecto directo en la población espermática. El último capítulo (VII) profundiza en la línea de estudio de la cromatina espermática en los capítulos V y VI. El éxito de la IA depende de una correcta estructura de la cromatina espermática, que es crucial para la fertilidad. Por ello, se están intentando aplicar nuevos métodos que permitan identificar alteraciones en la cromatina y detectar verracos subfértiles. El análisis de la cromatina porcina es especialmente complejo debido a su estructura, altamente compactada. Esta Tesis ha desarrollado y evaluado técnicas para realizar un estudio integral de la cromatina, detectando daños en el ADN y cambios en su estructura. Todas las variables se evaluaron globalmente usando un análisis multivariante, para evaluar la asociación entre las variables y los efectos de varios factores. Encontramos que los parámetros que indican daños en la cromatina mostraron dinámicas distintas durante el almacenamiento refrigerado de las dosis. Así, inicialmente las especies reactivas de oxígeno (ROS) y la oxidación en el ADN espermático no se correlacionaron, pero sí lo hicieron tras el almacenamiento. Lo contrario ocurrió entre las variables de la fragmentación y la oxidación en el ADN, que mostraron una correlación inicial, que desapareció tras 11 días. Además, en este capítulo (VII) realizamos un análisis de componentes principales (PCA), que mostró que el PC (componente principal) que capturó la mayor parte de la varianza estaba principalmente asociado con el análisis de puentes disulfuro, sugiriendo que su dinámica puede ser relevante durante el almacenamiento refrigerado. Además, parece que los parámetros derivados del sperm chromatin structure assay (SCSA) y 8–oxo–7,8-dihidro-2'-desoxiguanosina (8-oxo-dG) aportan información diferente sobre la cromatina y complementaria, quizás, a la de los puentes disulfuro. La combinación de la evaluación de SCSA, 8-oxo-dG y de los puentes disulfuro parece proporcionar una imagen completa del estado del núcleo espermático en verraco. En concreto, la detección de la oxidación del ADN con 8-oxo-dG (puesta a punto para porcino en esta Tesis) y la evaluación de los puentes disulfuro podrían ser útiles detectando la variabilidad entre los machos (detección de la subfertilidad) tras el almacenamiento. Sin embargo, la cromomicina A3 (CMA3) fue menos informativa. Los resultados de esta Tesis deberían ensayarse con estudios de fertilidad para obtener conclusiones robustas sobre la utilidad de estas técnicas para mejorar y predecir la fertilidad de los verracos, lo cual aportaría información útil y potencialmente aplicable al sector porcino, que obtendría grandes beneficios.