Characterization of physiological and molecular responses in common bean upon "Pseudomonas syringae" pv. "phaseolicola" infectionthe role of pectins in the defensive processes

Resumen

Las plantas normalmente están sometidas a todo tipo de estreses, entre ellos los causados por patógenos, que dificultan su supervivencia. Pese a ser organismos sésiles, las plantas han desarrollado un verdadero y completo sistema inmune para combatir a estos atacantes, el cual está finamente regulado. Así, durante el ataque de un patógeno, las células de la planta desencadenan una serie de mecanismos, que de ser eficientes, evitan la dispersión del patógeno por la planta y por tanto la enfermedad. Una de las respuestas más rápidas, es la liberación de peróxido de hidrógeno y otras especies reactivas de oxígeno (ROS), que sirven como antimicrobiano pero también como moléculas de señalización junto con el calcio. Esta señalización induce la rápida liberación de hormonas, como el ácido salicílico (SA) en el caso de patógenos biotrofos, las cuales desencadena una respuesta hipersensible (HR) que bloquea el avance del patógeno. Si la planta es resistente al patógeno, será muy eficiente y rápida activando estos mecanismos, y bloqueará rápidamente el avance del patógeno. La mayoría de estos procesos se han estudiado en plantas resistentes a un determinado patógeno, pero se sabe poco de qué ocurre durante una interacción en la que la planta es susceptible, lo que sería interesante para desarrollar estrategias para reducir la enfermedad. Además, en estos procesos de inmunidad, la pared celular, al ser la primera barrera física, juega un papel importante. De la capacidad de la planta para remodelar la arquitectura de la pared celular y, consecuentemente, sus propiedades fisicoquímicas, dependerá que el patógeno sea capaz o no de penetrar en la célula. Uno de los pato-sistemas que puede servir de modelo para conocer en mayor profundidad los procesos de patogenicidad, es el formado por la alubia común (Phaseolus vulgaris L.) y Pseudomonas syringae pv. phaseolicola (Pph), que produce la enfermedad de la grasa. Los principales síntomas son clorosis, problemas en el crecimiento y manchas características en hojas, tallo y vainas, lo que conlleva una menor producción. El estudio de esta enfermedad desde el punto de vista fisiológico es muy importante para la provincia de León, ya que dentro de su IGP recae casi el 50% de la producción de alubia a nivel nacional. De todas sus variedades, la alubia variedad Riñón es la más apreciada y rentable a nivel económico, pero es muy susceptible al ataque de la bacteria. Esta tesis ha tenido como objetivo obtener más información sobre los procesos fisiológicos que podrían explicar la susceptibilidad de la alubia común variedad Riñón a la bacteria Pph, centrándonos en el papel principal que puede tener la remodelación de la pared celular, especialmente las pectinas, para obtener una solución que active de alguna manera la inmunidad de la alubia. Nuestras hipótesis de partida son que Pph inhibe el sistema inmune de la alubia Riñón en algún punto durante la infección, probablemente al inicio, lo cual desencadena la enfermedad. De conocer este mecanismo de inhibición o encontrar el punto de la ruta de defensa que es bloqueado, sería posible buscar una solución para evitarlo. Por otro lado, si somos capaces de activar o reforzar el sistema de defensa de la alubia, sería posible reducir los efectos de la enfermedad o incluso evitarla por completo. Además, creemos que la pared celular puede jugar un papel clave en la defensa y reconocimiento del patógeno. Para abordar estos estudios, hemos realizado una serie de experimentos in vitro con el fin de forzar la infección con la bacteria evitando la interferencia con otros estreses, y poder estudiar qué ocurre en los primeros momentos de la infección tanto a nivel fisiológico como molecular. Además, se han llevado a cabo experimentos de elicitación del sistema inmune de la alubia, tanto con compuestos químicos como el INA, como con preparados a base de plantas (PBPs), y se ha realizado un análisis de los cambios que se producen en la pared celular de alubia tras la infección y/o elicitación de la planta. De esta manera, se establecieron 4 objetivos parciales que constituyeron cada uno de los capítulos de esta tesis. Objetivo 1: estudiar la percepción y primeras respuestas de defensa que se activan en la alubia común variedad Riñón tras la infección con Pph (capítulo I). Para ello se analizaron algunas respuestas típicas de PTI, como son la producción masiva de ROS y el influjo de calcio, actividades antioxidantes, fitohormonas relacionadas con defensa, como el ácido salicílico y el ácido abscísico, y el análisis de expresión de genes relacionados con defensa. Además, se identificaron in silico 6 receptores WAK, cuya expresión también se analizó. Como resultado, se obtuvo que al menos PvWAK1 aumenta su expresión a los pocos minutos tras la infección, lo que podría indicar un posible papel en defensa. Además, se produjo un incremento del H2O2 total y apoplástico y un aumento en la expresión de PR1, pero no una activación del sistema antioxidante y, sobre todo, no se detectó un pico de SA, lo que probablemente evitó la activación de HR. En nuestra variedad de alubia, la falta de estos mecanismos defensivos conllevó un daño celular temprano y alta susceptibilidad a Pph. El hecho de que la expresión de PvWAK1 aumentara después de la infección con Pph podría indicar que los efectores de la bacteria no inhibieron la expresión de este receptor, al menos en etapas tempranas, y podría ser interesante considerarlo en programas de mejora o de ingeniería genética. Finalmente, también este estudio abre la puerta a investigar si la aplicación de oligómeros para activar las respuestas de defensa en alubia a través de los receptores PvWAK. Objetivo 2: conocer si el sistema inmune de esta variedad de alubia podía ser activado previamente a la infección, y si esta activación conllevaba, al igual que la infección por sí misma, una remodelación de la pared celular (capitulo II). Para ello, plantas pretratadas o no con un análogo estructural de SA, llamado INA, fueron inoculadas o no con Pph, y en ellas se realizó un análisis de sus paredes celulares y de activación del sistema de defensa mediante liberación de ROS. Como resultado, la activación del sistema inmune con INA produjo una mayor cantidad de ROS después de la incubación con flg22, y las plantas tratadas con INA fueron más resistente a la infección con Pph. La inoculación con Pph modificó la pared celular, pero en menor medida que cuando se activó el sistema inmune con INA. En general, la infección con Pph no modificó el contenido en celulosa, pero sí incrementó el de pectinas (homogalacturonano y ramnogalacturonano I) en fracciones pécticas (CDTA y Carbonato), y el de hemicelulosas (arabinoxilanos) en la fracción de hemicelulosas fuertemente unidas a la pared (fracción KII). La masa molecular de los polisacáridos aumentó sobre todo en la fracción carbonato, pero la pared celular resultó ser tan digerible enzimáticamente como la pared celular extraída de las plantas control. Por el contrario, el tratamiento con INA produjo un drástico remodelado de las paredes celulares extraídas. El contenido en celulosa aumentó, se produjo un desplazamiento entre las fracciones de los polisacáridos matriciales extraídos, así como un incremento de la masa molecular de los polisacáridos extraídos en cada fracción. Esto último podría estar relacionado con un incremento tanto en pectinas como en extensinas en todas las fracciones, lo que produjo un mayor entrecruzamiento entre polisacáridos dando lugar a una pared celular más resistente a la hidrólisis enzimática. La posterior inoculación con Pph en plantas pretratadas con INA, no modificó las paredes celulares respecto a las sólo tratadas con INA. Además, las plantas elicitadas con INA presentaron menos daños en sus hojas que las plantas control tras la infección con Pph. Objetivo 3: obtener información de los genes implicados en la respuesta temprana de la alubia Riñón a Pph. Para ello, plantas de alubia de 15 días de edad fueron inoculadas o no con Pph, y transcurridas 2 o 9 horas de la infección, se extrajo el RNA para realizar un análisis transcriptómico mediante RNAseq (capítulo III). A las 2 horas tras la infección, se observó una sobreexpresión de genes relacionados con defensa, pero este incremento de expresión no se sostuvo a lo largo del tiempo. Esto también se observó cuando se cuantificaron fitohormonas relacionadas con defensa, como el salicílico, jasmónico y abscísico, y en la expresión de genes relacionados con pared celular. El análisis en monosacáridos de pared reveló un aumento en la cantidad de azúcares a las 2 horas post-infección, pero de nuevo disminuyó a las 9 horas, salvo para el GalA, lo que sugería un incremento de la síntesis de pectinas o una reducción de su degradación. Ésta segunda opción se confirmó al observar que la mayoría de las actividades relacionadas con degradación de pectinas (PL, PG y PME) había disminuido, mientras que la expresión de genes relacionados con enzimas inhibitorias de PME (PMEIs) aumentó. Esto podría ser una estrategia de protección de la pared celular de la planta frente a las actividades degradativas de pectinas que presenta Pph, como se ha observado en este trabajo. Otra posible estrategia de protección de la integridad de las pectinas, y por tanto de la pared celular, podría ser la formación de cajas de huevos, tal y como hemos observado mediante inmunohistoquímica. Para la formación de estas cajas de huevos es necesaria la desmetilación de las pectinas y aunque la actividad general PME disminuyó, algunos genes para PMEs, como el ortólogo de Arabidopsis PvPME17, aumentaron su expresión. Además, una explicación para que se viese disminuída la actividad PME podría ser la sobreexpresión de PMEIs. Entre otros, PvPMEI3, ortólogo de Arabidopsis de PMEI3, fue el que más aumentó su expresión. El análisis funcional de este gen se evaluó en mutantes de Arabidopsis pmei3, los cuales mostraron una susceptibilidad a Pph que los correspondientes controles no tenían. Finalmente, se demostró que PvPMEI3 tenía actividad PMEI, y podría jugar un papel clave en la resistencia de la alubia común frente a la infección por Pph. Por último, el capítulo IV fue dedicado al cribado de preparaciones basadas en plantas por su capacidad de inhibición del crecimiento de Pph, así como probar si alguno de ellos era capaz de activar el sistema de defensa de la planta, evaluando algunos de los parámetros fisiológicos y moleculares relacionados con defensa previamente estudiados. En resumen, se probaron 4 preparaciones basadas en plantas, de las cuales 2 fueron las más efectivas (hollejo de uva tras la fermentación del vino y ortiga) para inhibir el crecimiento de Pph. Solo el tratamiento con ortiga conllevó la activación de algunos mecanismos de defensa, como los procesos de señalización redox y el aumento de los niveles de expresión de genes relacionados con defensa, sobre todo PR1. Las plantas de alubia tratadas con estos productos no disminuyeron su producción final. Los primeros ensayos in vitro, además, sugieren que la aplicación de ortiga puede proteger a la alubia de la infección con Pph. Todos estos resultados sugieren que las preparaciones a base de plantas de Urtica dioica podrían usarse en un futuro cercano para disminuir los efectos de la enfermedad de la grasa. En definitiva, la presente tesis ha profundizado en los mecanismos de interacción en el patosistema alubia riñon-Pph, mostrando algunas de las posibles causas de susceptibilidad, como es la falta de producción de SA a tiempos cortos tras la infección, lo cual posiblemente impida que la alubia refuerce su pared celular y active otros mecanismos de defensa como HR y SAR. De hecho, hemos demostrado que la alubia puede ser elicitada con un análogo estructural de SA, lo cual conlleva un fuerte reforzamiento de pared que hace que la planta sea menos susceptible a Pph y tenga una pared celular más reforzada con pectinas y extensinas, y por tanto menos digerible enzimáticamente. El papel de las pectinas en el mecanismo de defensa ha quedado demostrado también a través del análisis de transcriptoma que hemos realizado en este trabajo, mediante el cual hemos comprobado que algunas enzimas implicadas en el metabolismo y modificación de las pectinas juegan un papel clave en el proceso de defensa, como PMEI3, cuya mutación en plantas de Arabidopsis conlleva que la planta muestre una susceptibilidad a Pph que los controles no tienen. Por último, hemos comprobado que la elicitación del sistema de defensa de la planta también es posible a través de productos basados en plantas, lo cual abre una puerta muy interesante para la generación de fitosanitarios ecológicos que se puedan aplicar en campo.