Factores que afectan al proceso de criopreservación de los espermatozoides humanos.

Resumen

Resumen Objetivo: El objetivo de la presente tesis doctoral, por compendio de publicaciones, es el estudio de diversos factores que influyen en el resultado de proceso de congelación-descongelación de espermatozoides. Por un lado, estudiamos factores que no dependen directamente de las características propias de la muestra, es decir, son factores extrínsecos como son el protocolo de descongelación (estudio 1) y la adición de sustancias antioxidantes a los medios de descongelación (estudio 2). Por otro lado se analizan una serie de factores que podemos clasificar de intrínsecos de la muestra, como son la composición en ácidos grasos o la capacidad antioxidante del plasma seminal y que determinan en parte el éxito de la congelación (estudio 3). Metodología: En el primer estudio evaluamos un protocolo en el que se produce una rápida dilución de la muestra congelada. Para ello introducimos la muestra en el medio de descongelación a 37ºC durante 20 minutos y lo comparamos con el método habitual de descongelación que utilizamos que consiste en mantener la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente y posterior incubación a 37ºC otros 10 minutos antes de añadir el medio de descongelación. En el segundo trabajo estudiamos los efectos que provoca la adición de genisteína, a concentraciones de (0, 1 y 10 µmol L -1) tanto al medio de congelación como al de descongelación. En el tercer trabajo determinamos, mediante cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), la composición en ácidos grasos tanto del plasma seminal como de los espermatozoides. También evaluamos, mediante espectrofotometría, la capacidad antioxidante total (TAC) del plasma seminal. Estudiamos la posible relación de estos parámetros con la calidad espermática de la muestra, tanto antes como después del proceso de congelación-descongelación. Resultados: Al descongelar las muestras seminales mediante inmersión en medio a 37ºC observamos una mejora estadísticamente significativa en determinados parámetros cinéticos como el porcentaje de espermatozoides con movilidad rápida y progresiva, así como una menor proporción de espermatozoides con alteración en el acrosoma y una menor condensación en su cromatina. Igualmente, con este método de descongelación se detecta un incremento en el porcentaje de espermatozoides viables que presentaban un bajo desorden lipídico. La genisteina a concentraciones de (10 µmol L-1) tiene efectos antioxidantes que limitan o contrarrestan la generación de agentes reactivos de oxígeno (ROS). Por lo que la adición de genisteina al medio de descongelación va a originar una ligera mejora en la motilidad espermática así como una reducción en la fragmentación del ADN. Por otra parte se observa un menor desorden lipídico en los espermatozoides descongelados mediante la adición de esta sustancia. En el tercer estudio observamos una correlación positiva entre ácidos grasos Poliinsaturados (PUFAs), en especial los ácidos omega 3, con la motilidad y viabilidad de los espermatozoides. De igual manera encontramos una relación entre la composición de ácido docosahexanoico (DHA) y de ácido esteárico (C18:0) en plasma seminal con la motilidad de los espermatozoides antes y después de congelar. La capacidad antioxidante total (TAC) en plasma seminal se relaciona directamente con las concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA). También observamos una estrecha relación de este parámetro con la motilidad de la muestra descongelada. Conclusiones: Con estos trabajos hemos demostrado que la modificación de ciertos factores extrínsecos ocasiona mejoras estadísticamente significativas en la congelación - descongelación de espermatozoides. A la vez hemos puesto de manifiesto la existencia de factores intrínsecos de la muestra que determinan el resultado de la criopreservación. Así encontramos que la composición de los ácidos grasos en la membrana de los espermatozoides está estrechamente relacionada con la calidad seminal tanto antes como tras la congelación-descongelación. Summary Objective: In the current study, we have analyzed several factors and its influence the result of freeze-thawing spermatozoa. We study factors that are not directly dependent on the characteristics of the sample, extrinsic factors. These factors studied are thawing protocol (study 1) and the addition of antioxidants to the media (study 2). In the third study we have analyzed intrinsic factors to the sample, such as fatty acid composition and antioxidant capacity of seminal plasma that could predict the success of the freeze. Methodology: In the first study, we evaluated the effects of a novel thawing methodology on sperm function after cryopreservation versus traditional protocols. Samples were immersed directly in thawing medium at 37ºC for 20 minutes versus 10 minutes in air at room temperature and subsequently 10 minutes at 37ºC. This procedure leads to a higher rate of temperature increase and a dilution of the glycerol present in the freezing medium. In the second study, we evaluated the effects of genistein supplementation (0, 1 y 10 µmol L-1 ) in freezing and thawing extender on frozen and thawed human semen parameters. Genistein is an isoflavone with antioxidant properties and inhibits protein tyrosine Kinases. In the third study, we analyzed, by high performance liquid chromatography (HPLC), the fatty acid composition of both the seminal plasma and sperm. We used spectrophotometry methods to evaluated total antioxidant capacity (TAC) of seminal plasma. The relationships between fatty acid composition and TAC sperm quality, measured in terms of viability and motility, before and after freezing-thawing were analyzed. Results: Sperm thawing with this alternative method present higher viability, an improved in motility parameter and less acrosome damage. We also detected an increase in the percentage of viable spermatozoa with low membrane lipid disorder and a reduction in chromatin condensation. We have confirmed that the isoflavone genistein has antioxidant effects and decrease the membrane lipid disorder and DNA damage caused by cryopreservation. Reduction in ROS production as well as a slight improvement in motility parameters is other effects caused by the use of this isoflavone. We found a significantly positively correlated between polyunsaturated fatty acids (PUFAs), ?3 PUFAs in special Docosahexaenoic acid (DHA) in sperm with sperm viability and motility parameters before and after freezing. Motility parameters before and after freezing were related to stearic acid (C18:0) and DHA in seminal plasma. Total antioxidant capacity in seminal plasma was directly related to PUFAs and motion parameters after thawing. Conclusions: In this doctoral thesis we have found that modification of extrinsic factors could improve sperm functionality in cryopreservation process. Also, we have shown that intrinsic factors could be able to predict the outcome of cryopreservation. New studies should be included randomized and controlled trials, in order to test whether these changes in addition to statistical significance have clinical significance. We have found that the composition of fatty acids in the sperm membrane is closely related to sperm quality both before and after freezing and thawing.