Estudio del estres oxidativo en espermatozoides epididimarios crioperservados del ciervo

Résumé

Los bancos de germoplasma tienen una gran importancia para la gestión y conservación de rumiantes silvestres. En el caso del ciervo rojo, su importancia socioeconómica exige el uso de técnicas de reproducción asistida, para lo cual es imprescindible mejorar nuestros conocimientos sobre la fisiología espermática y la preservación seminal. En la presente tesis, se ha abordado esta problemática desde la perspectiva del impacto del estrés oxidativo en los espermatozoides epididimarios descongelados de esta especie, así como su prevención. El estrés oxidativo puede provocar una pérdida considerable de calidad espermática, habiendo siendo estudiado en numerosas especies y proponiéndose diversas soluciones, generalmente basadas en la suplementación de las dosis seminales con sustancias antioxidantes. En una primera etapa, realizamos un estudio para determinar si el lavado post-descongelación de los espermatozoides, una técnica rutinaria de procesamiento seminal, inducía estrés oxidativo o un incremento en la vulnerabilidad de éstos. Determinamos que ni la dilución ni la centrifugación-resuspensión sin cambio de medio provocaban un estrés oxidativo detectable, ni un incremento en la vulnerabilidad de los espermatozoides a un estrés oxidativo inducido. No obstante, el lavado (centrifugación y cambio de medio) incrementó el daño producido (movilidad, estado mitocondrial, viabilidad y roturas en ADN) al incubar en presencia de un inductor de estrés oxidativo. La presencia del antioxidante Trolox (un análogo de la vitamina E) evitó este daño, indicando un posible efecto beneficioso de estos aditivos durante el manejo de los espermatozoides post-descongelación. En un segundo experimento, comprobamos el efecto de varias sustancias antioxidantes durante la incubación post-descongelación de los espermatozoides. Los antioxidantes elegidos fueron el ácido lipoico, la melatonina, la crocina y Trolox. La incubación a 37 °C (4 h) incrementó la concentración de especies reactivas del oxígeno (ROS) intracelulares y redujo la movilidad espermática, siendo estos efectos mayores al aplicar estrés oxidativo exógeno, el cual además aumentó los niveles de peroxidación lipídica y el daño al ADN. La aplicación de Trolox (1 y 0,1 mM) evitó la mayor parte de los efectos negativos de la incubación y del estrés oxidativo exógeno. El ácido lipoico no tuvo ningún efecto protector. En el caso de la melatonina, pudimos apreciar un efecto positivo por encima de 1 mM, reduciendo las ROS intracelulares, la lipoperoxidación y anulando los daños al ADN. La crocina estimuló la movilidad espermática y redujo el daño al ADN, aunque elevó las ROS en muestras no sometidas a estrés oxidativo, e incrementó los niveles de peroxidación lipídica. Los resultados de este experimento sugieren la idoneidad del Trolox, incluso a bajas concentraciones, y la posible utilidad de la melatonina como antioxidante en el semen descongelado. La crocina queda pendiente de futuros experimentos, para evaluar los resultados, en parte contradictorios, obtenidos en esta tesis. En un tercer estudio, determinamos el efecto de dosis crecientes de peróxido de hidrógeno (H2O2) sobre los espermatozoides descongelados y lavados. Tras una incubación de 2 h a 37 °C, encontramos que los espermatozoides apenas fueron afectados a dosis hasta 100 µM de H2O2, encontrando un efecto negativo a 200 µM. Este efecto consistió principalmente en la disminución de la movilidad y en un incremento del daño al ADN espermático (determinado mediante SCSA). Este estudio muestra que los espermatozoides de ciervo podrían tener cierta resistencia al daño oxidativo, incluso en ausencia de antioxidantes. No obstante, no podemos descartar daños más sutiles, especialmente en el ADN. En ese estudio, no conseguimos detectar un incremento apreciable de la peroxidación lipídica, que fue evaluada mediante la prueba de las TBARS (especies reactivas del ácido tiobarbitúrico). Por lo tanto, nos planteamos estudiar la sensibilidad y repetibilidad de esa prueba en espermatozoides de ciervo, comparándola con las sondas fluorescentes BODIPY 581/591 C11 (B581) y BODIPY 665/676 C11 (B665), diseñadas para detectar peroxidación lipídica. Hay que destacar que esta ha sido la primera vez que se ha comunicado el uso de B665 con espermatozoides. Ambas sondas fluorescentes fueron analizadas mediante citometría de flujo y en un lector de placas (fluorímetro), para comparar la idoneidad de estas técnicas para este análisis. La técnica de TBARS detectó un incremento de peroxidación lipídica sólo cuando los espermatozoides se incubaron a tiempos largos con sustancias oxidantes (peróxido de hidrógeno e hidroperóxido de terc-butilo) a altas concentraciones, mostrando una repetibilidad y sensibilidad mediocres. Ambas sondas BODIPY mostraron una buena repetibilidad y sensibilidad, especialmente al ser analizadas mediante citometría de flujo, pudiendo detectar peroxidación lipídica en distintas condiciones de incubación. La lectura en fluorímetro produjo resultados satisfactorios, aunque algo menos sensible que la citometría, y podría ser una alternativa de bajo coste para evaluar peroxidación lipídica mediante estas sondas fluorescentes. En varios de los experimentos de esta tesis, se aprovechó para estudiar la variabilidad individual al daño oxidativo, al utilizar muestras de distintos machos. En el primer experimento, determinamos que las muestras de distintos machos presentaban distintos grados de resistencia al estrés oxidativo tras el lavado post-descongelación. Este estudio se retomó al analizar la resistencia de los espermatozoides a dosis crecientes de H2O2. Cuando se evaluó el efecto de este oxidante sobre muestras procedentes de machos individuales, encontramos grandes diferencias tanto en la respuesta al estrés oxidativo como a la incubación (incluso en ausencia de éste). Estos resultados pueden tener gran relevancia en el desarrollo de protocolos de manipulación y preservación de muestras espermáticas, ya que las muestras vulnerables podrían requerir un tratamiento especial, a pesar de observarse una buena resistencia en otras muestras.