Evaluación de la liberación de endotoxinas bacterianas inducida por antibióticos utilizados en el tratamiento de mamitis en ganado bovino

Resumen

La mamitis es una de las enfermedades más comunes en el ganado lechero y causa de importantes pérdidas económicas en el sector lácteo en todo el mundo, así como de efectos negativos sobre el bienestar animal. Se caracteriza por una reacción inflamatoria de la glándula mamaria que produce cambios significativos en la composición bioquímica de la leche, estando asociada principalmente a infecciones por bacterias, tanto Gram negativas como positivas. La liberación de endotoxinas asociada a la lisis bacteriana es un factor relevante en el curso clínico de la mamitis causada por bacterias Gram negativas y debe tenerse en cuenta en el manejo clínico de estas infecciones empleando antibióticos. Es por ello que la detección de endotoxinas en muestras de leche puede ser una herramienta de gran utilidad en la gestión de la mamitis en las explotaciones lecheras. De forma similar, el estudio de la cinética de inhibición de diferentes bacterias patógenas y de la cinética de liberación de endotoxinas tras la exposición a diferentes antibióticos puede proporcionar información de interés para el manejo clínico de esta importante enfermedad. En esta Tesis Doctoral hemos optimizado un ensayo turbidimétrico cinético basado en lisado de amebocitos de Limulus (LAL) para la cuantificación de endotoxinas en muestras de leche, introduciendo en el procedimiento un pretratamiento de estas muestras mediante filtración a través de un filtro de polivinilo y dilución con el fin de minimizar las interferencias asociadas a esta compleja matriz. En una segunda etapa, hemos investigado, empleando esta técnica el efecto de algunos antibióticos empleados de forma habitual en el tratamiento de mamitis sobre el crecimiento bacteriano y la liberación de endotoxinas, empleando un sistema de cultivo en leche o cultivos mini-ubre que trata de reproducir las condiciones de la infección en la glándula mamaria. La técnica de detección y cuantificación de endotoxinas optimizada fue validada siguiendo las indicaciones establecidas por las normas de la Organización Internacional de Normalización, empleándose para la determinación en muestras de leche procedentes de animales con mamitis clínica asociada a bacterias tanto Gram negativas como positivas, en muestras de leche de tanque y en leches comerciales. Nuestros resultados demuestran la robustez y utilidad de este ensayo para la cuantificación de endotoxinas en un amplio rango de concentraciones, permitiendo identificar mamitis por coliformes en muestras de leche de animales con enfermedad clínica de la glándula mamaria, así como detectar endotoxinas en muestras de leche de tanque o incluso en algunas leches comerciales UHT (tratamiento a altas temperaturas). El modelo experimental optimizado de cultivo en leche o cultivos mini-ubre permitió simular las condiciones de una infección intramamaria con dos especies de bacterias Gram negativas, previamente aisladas de leches de animales con mamitis, Escherichia coli y Enterobacter aerogenes, y valorar el efecto de la exposición a cuatro antibióticos de uso habitual en el manejo de mamitis clínicas en ganado vacuno: bencilpenicilina, dihidroestreptomicina, cefalosporina y cefapirina. Se determinaron las cinéticas de inhibición de crecimiento y de liberación de endotoxinas en estos cultivos, comparándolas con las obtenidas en controles con idénticas condiciones, pero sin tratamiento antibiótico. Todos los antibióticos valorados, tal y como era de esperar, provocaron una reducción del crecimiento, más acentuado a partir de las 3-4 horas de exposición, aunque con diferencias en las cinéticas de inhibición en función del modo de acción. Además, todos los antibióticos generaron una liberación de endotoxinas en comparación con los controles que también varió en función del antibiótico. Así, la exposición a cefalosporinas se asoció a una muerte bacteriana más lenta y, al mismo tiempo, a una mayor liberación de endotoxinas, probablemente a consecuencia de fenómenos de filamentación bacteriana por cambios en la morfología de la membrana celular de las bacterias. Por el contrario, el tratamiento con dihidroestreptomicina combinó una rápida actividad bactericida con una liberación más reducida de endotoxinas, probablemente a consecuencia de una lisis celular rápida.