Streptococcus suiscaracterización fenotípica y molecular de aislados y desarrollo de una nueva vacuna recombinante

Resumen

Actualmente, las enfermedades respiratorias son uno de los problemas más relevantes en la industria porcina. La preocupación principal proviene del Complejo Respiratorio Porcino (CRP), término acuñado para describir los procesos de neumonía de etiología viral y bacteriana desarrollados en cerdos entre las 16 y 20 semanas de edad. Algunos de los agentes más relevantes en este grupo incluyen el Virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV), Glaesserella parasuis, Pasteurella multocida y Streptococcus suis. Junto con estos microorganismos, los factores no infecciosos (como el manejo de los animales y el control de los factores ambientales) contribuyen de forma decisiva a las enfermedades respiratorias, aumentando la diseminación de patógenos y creando condiciones desfavorables que producen estrés de los animales. En aspecto, S. suis es uno de los principales patógenos de la industria porcina. Esta bacteria Gram-positiva reside de forma asintomática en el tracto respiratorio superior, el intestino y los genitales de los cerdos como parte de su microbiota. La colonización por S. suis ocurre típicamente a través del contacto con la madre y entre los propios lechones durante y después del parto. Sin embargo, puede volverse patógeno cuando penetra a través de barreras mucosas. Una vez pasa estas barreras, la bacteria ingresa al torrente sanguíneo. En este punto, la cápsula de polisacáridos de S. suis permite la protección frente a la fagocitosis y la muerte mediada por monocitos y macrófagos. Por lo tanto, la bacteria puede sobrevivir en la sangre y diseminarse a través el sistema nervioso central y otros órganos del hospedador, causando cuadros clínicos que incluyen meningitis, septicemia, artritis, endocarditis, septicemia o muerte súbita en cerdos enfermos. Actualmente, el método de clasificación más común de la bacteria se basa en los antígenos de su superficie celular, lo que permite la detección de 29 serotipos. El serotipo más prevalente a nivel mundial es el serotipo 2, mientras que en Europa los serotipos 2 y 9 son los más prevalentes y tienden a ser los más virulentos. Sin embargo, los recientes avances en la tipificación de secuencias multilocus (MLST) han permitido clasificar las cepas de S. suis según su tipo de secuencia, detectando hasta 616 tipos de secuencia, de los cuales el 61 % pertenecen a serotipos específicos. En este sentido, esta Tesis Doctoral abordó el análisis de la distribución de serotipos de 909 aislados de S. suis de diferentes Comunidades Autónomas de España. Los serotipos más comunes entre los aislamientos fueron, en orden descendente, 9, 1-14, 2-1/2, 7, 3 y 8. Además, se detectaron por PCR los genes epf, mrp, sly, gapdh y luxS en 909 aislados, ya que su estudio puede proporcionar información útil sobre el perfil de virulencia de las cepas. Los factores de virulencia más detectados fueron, en orden decreciente, luxS, mrp, gapdh, sly y mrp. El patrón de virulencia más observado fue el patrón epf + /mrp + /sly + /luxS + /gapdh +. Además, se determinó si existía asociación entre aislados pertenecientes a los diferentes serotipos y la expresión de marcadores de virulencia específicos. Los análisis estadísticos dieron lugar a tres asociaciones estadísticamente significativas. La asociación más fuerte fue la correlación entre aislados pertenecientes a uno de los serotipos más significativos, con que su perfil de virulencia incluyera el patrón epf + /mrp + /sly +, con un valor p inferior a 0,0001. Por otro lado, en cuanto a la alta variabilidad entre las cepas de S. suis, los diferentes tipos de secuencias y serotipos son las principales dificultades para desarrollar una formulación vacunal eficaz que pueda proporcionar una protección amplia y duradera. Además, la bacteria puede evadir el sistema inmunológico del hospedador y sobrevivir dentro de este. Esta capacidad hace que la tarea de desarrollar una vacuna universal sea aún más difícil. Aunque muchos estudios han intentado desarrollar vacunas frente a S. suis, no se ha encontrado una solución completamente efectiva. Una vacuna eficaz debería poder estimular una respuesta inmunitaria que permita reconocer y neutralizar todas las variantes de la bacteria. Por ello, en esta Tesis Doctoral se eligieron dos proteínas altamente conservadas como candidatos vacunales para tratar de conseguir una protección completa y potencialmente heteróloga frente a S. suis. A partir de las secuencias de estas proteínas se diseñaron dos proteínas recombinantes, las cuales se obtuvieron mediante protocolos de expresión y purificación de proteínas. Posteriormente, se prepararon tres formulaciones vacunales con el adyuvante correspondiente y se realizó una prueba de inmunización en ratones para evaluar el título de anticuerpos desarrollados por la vacuna. Tanto la proteína A como la proteína B demostraron ser proteínas capaces de provocar la seroconversión en ratones BALB/c tras su administración intraperitoneal. Sin embargo, no pudieron proteger a los ratones frente al desafío con una cepa virulenta de S. suis del serotipo 2. Asimismo, la proteína A fue más inmunogénica que la proteína B y la combinación de ambas. Sin embargo, las condiciones de prueba experimental en ratones y los protocolos de expresión de proteínas recombinantes deben optimizarse con el fin de permitir una mejor extrapolación de los resultados obtenidos, lograr una mayor eficiencia en los procedimientos realizados y transferir eventualmente la prueba experimental a cerdos. No obstante, se debe tener en cuenta que, además de la amenaza que representa la bacteria, la resistencia que está desarrollando a los antibióticos, al igual que ocurre con otros patógenos, se está convirtiendo en un problema emergente. De hecho, según un informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 2019, alrededor de 2,4 millones de personas podrían morir en los países desarrollados entre 2015 y 2050 en ausencia de un plan estratégico para controlar las resistencias a los antibióticos. En la presente tesis doctoral, se evaluó la prevalencia de seis genes de resistencia a antibióticos (GRAs), además de la susceptibilidad a dieciocho antibióticos, con el objetivo de determinar el tratamiento más efectivo para la enfermedad causada por S. suis en cerdos. Además, se determinó si existía una asociación entre la presencia de GRAs frente a una familia específica de antibióticos y la resistencia observada a nivel fenotípico cuando el aislado era expuesto a esa familia de antimicrobianos. Los genes de resistencia más detectados entre los 303 aislamientos estudiados fueron, en orden decreciente, tet(O), erm(B), lsa(E) y lnu(B), tet(M) y mef(A/E). Asimismo, el patrón de resistencia más detectado fue el patrón erm(B) + /mef (A/E) − /tet(M) - /tet(O) + /lsa(E)/lnu(B) −. Por otro lado, en cuanto a la susceptibilidad antimicrobiana, los antibióticos más efectivos para inhibir el crecimiento de S. suis fueron, en orden decreciente, la ampicilina, la gentamicina y el ceftiofur. Asimismo, los antibióticos menos efectivos para inhibir el crecimiento bacteriano fueron la sulfadimetoxina, la clortetraciclina y la oxitetraciclina. Finalmente, el estudio de la asociación entre la presencia de genes específicos de resistencia a antibióticos (GRAs) y la resistencia observada a nivel fenotípico permitió detectar hasta siete asociaciones estadísticamente significativas. La asociación más fuerte fue la que relacionaba la presencia del gen tet(O) con la resistencia observada a nivel fenotípico para clortetraciclina y oxitetraciclina, con un valor de p inferior a 0,0001. Por lo tanto, se ha comprobado que los aislados de S. suis utilizados en este estudio cuentan con patrones de AMR preocupantes, ya que las pruebas de susceptibilidad a los antibióticos mostraron niveles de resistencia muy elevados. Además, los dos candidatos vacunales indujeron efectivamente la seroconversión en ratones BALB/c. Sin embargo, se requerirán protocolos de optimización para mejorar los títulos de IgG obtenidos.