Characterization of the main factors controlling boletus edulis and boletus reticulatus mycorrhization on chestnut hybrids (castanea x coudercii)

Resumen

Alrededor del 92% de los árboles y el 85% de los arbustos mantienen una relación mutuamente beneficiosa con un hongo asociado, que se denomina micorriza (del griego mykes: hongo y rhiza: raíz). Desde un punto de vista biológico, las micorrizas se definen como asociaciones simbióticas entre los hongos del suelo y las raíces más finas de las plantas vasculares. En esta simbiosis, los hongos suministran agua y nutrientes minerales ampliando la cantidad de suelo accesible a las plantas y ofrecen tolerancia al estrés biótico y abiótico, mientras que las plantas proporcionan a los hongos moléculas orgánicas derivadas de la fotosíntesis. Esta interacción hongo-planta desempeña un papel esencial en los ecosistemas, en particular en la nutrición de las plantas, la biología y la química del suelo. En la actualidad se diferencian hasta siete tipos de micorrizas en función de sus características estructurales y el grado de penetración de las hifas fúngicas en el epitelio radical. Las ectomicorrizas son una categoría de micorrizas que establecen simbiosis con el 2-3% de las plantas leñosas (335 géneros y 8.500 especies), distribuidas principalmente en bosques templados, boreales y tropicales de todo el mundo. Estas plantas tienen una elevada importancia a nivel global y un gran impacto económico debido a la enorme superficie terrestre que cubren. El conjunto de especies ectomicorrícicas (ECM) que colonizan las raíces en las primeras etapas del desarrollo del árbol se definen como especies de ¿etapas tempranas¿, mientras que las especies fúngicas que se instalan a medida que el árbol envejece, son las de ¿etapa tardía¿. Clásicamente, se consideran hongos de ¿etapa temprana¿ las especies fúngicas pertenecientes a los géneros Hebeloma, Inocybe, Laccaria, Paxillus, Pisolithus, Scleroderma y Suillus, que pueden estar asociados a una amplia variedad de plantas y fructifican alrededor de árboles jóvenes. Por otra parte, especies pertenecientes a los géneros Boletus, Lactarius, Leccinum y Russula, fructifican bajo árboles adultos, y se consideran especies de ¿etapas tardías¿. Las ectomicorrizas también interaccionan con otros microorganismos edáficos que albergan en sus hifas. Estas interacciones pueden ser sinérgicas, competitivas o antagónicas. Se han descubierto bacterias con potencial para fijar el nitrógeno que crecen simbióticamente con las raíces tuberculadas de plantas con ectomicorrizas, formando nódulos de raíces y funcionando como rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal o PGPR (Plant Growth Promoting Rhizobacteria). De particular interés son aquellas bacterias facilitadoras de la micorrización, conocidas como ¿Mycorrhiza Helper Bacteria¿ (MHB). Las MHB interactúan con los hongos reduciendo el estrés del micelio, estimulando su crecimiento y facilitando el contacto entre raíces y hongos. Estas interacciones bióticas no son casuales y pueden ser esenciales para asegurar una micorrización estable de hongos ECM en la planta huésped. Las cepas MHB que se han identificado hasta la fecha pertenecen al filo Proteobacteria (las bacterias gram-negativas del género Pseudomonas), Firmicutes (los gram-negativos del género Bacillus) y Actinomycetes (las bacterias gram-positivas del género Streptomyces). Los hongos ECM asociados con una planta se pueden describir y cuantificar a través de (1) los carpóforos en superficie, (2) el micelio extra-radical debajo del suelo y (3) la recolección de ectomicorrizas asociadas con el aparato radicular de la planta. Tradicionalmente se han descrito y cuantificado los hongos ECM exclusivamente a través de la identificación morfológica de los carpóforos, sin embargo, este método es cada vez menos usado gracias al avance de los análisis moleculares, que propició estudios muy detallados de la riqueza y diversidad de especies. Una ventaja del estudio de micorrizas recogidas directamente de las raíces de la planta es que esto asegura la identidad de la planta huésped, a diferencia de lo que ocurre con los muestreos de carpóforos, para los cuales es difícil establecer con exactitud la identidad del árbol asociado. Además, la riqueza de especies de la comunidad de hongos que fructifica en superficie no se corresponde exactamente con la comunidad fúngica que se desarrolla a nivel de las raíces. Como se ha indicado anteriormente, las asociaciones de ectomicorrizas proporcionan grandes beneficios para la planta, tanto individualmente, mejorando su vigor y salud, como colectivamente mejorando la productividad de los bosques naturales y de los ecosistemas agro-forestales. Estos beneficios consisten en una mejora nutricional, ya que los hongos ECM multiplican la superficie radical de la planta asegurando una mejor absorción de los nutrientes minerales. Por ello, la inoculación de estos hongos en las explotaciones agro-forestales permitiría reducir el consumo de fertilizantes promoviendo un cultivo sostenible y también en un incremento de la protección del sistema radicular frente a los patógenos, ya que el manto de la ectomicorriza proporciona una barrera física contra posibles enfermedades. Gracias a estas características, el uso de las ectomicorrizas permitiría disminuir el consumo de productos químicos perjudiciales para los ecosistemas como los pesticidas, plaguicidas y herbicidas sintéticos. A estos beneficios hay que añadir el gran potencial económico que tienen las setas (definidas también como carpóforos o esporocarpos) producidas por algunas especies ectomicorrícicas. Si además de inducir/reforzar la micorrización de la planta, se consiguiese controlar la fructificación de carpóforos con interés gastronómico se obtendría un valor añadido a la explotación agroforestal. De hecho, los carpóforos de los hongos ECM se encuentran entre los alimentos más caros del mundo, alcanzando miles de millones de dólares a nivel mundial. Según el último informe nacional para la evaluación de los recursos forestales mundiales, en España se comercializaron setas de especies ECM provenientes de explotaciones forestales por valor de más de 110 millones de euros. El consumo de estas setas aún depende exclusivamente de su recolección en bosques naturales. Por esta razón, existe un gran interés en lograr el cultivo exitoso de hongos ECM comestibles, pues sus setas son muy apreciadas por sus características organolépticas, y en muchos casos también nutracéuticas. La fructificación natural de las setas en campo es escasa para abastecer la elevada demanda mundial que hay de algunas especies como por ejemplo Boletus edulis. Los obstáculos que se interponen al cultivo de hongos ECM son inherentes a su condición simbiótica: estas especies requieren establecer una relación micorrícica con una planta hospedadora compatible, y dependen de factores bióticos y abióticos para mantener esa relación y fructificar en campo. En teoría, el protocolo necesario para lograr con éxito el cultivo de carpóforos de hongos ECM pasa por estas fases: (1) producir un inóculo viable del hongo ECM de interés, (2) inocular las raíces de las plantas y garantizar la formación de la micorriza, (3) asegurar y mantener la micorrización en campo, y (4) controlar y modular los factores que inducen la fructificación del micelio. Todas estas fases se han implementado con relativa facilidad en hongos ECM no comestibles, fundamentalmente en aquellos de mayor interés agroforestal por mejorar la calidad de la planta, como el hongo de etapa temprana Pisolithus arhizus (anteriormente, P. tinctorius). Estos hongos micorrícicos no comestibles son de especial interés en viveros forestales, donde se realiza una micorrización natural en maceta. Tradicionalmente, los viveristas de árboles forestales conocen la importancia de un buen sistema de raíces ectomicorrícicas en las plántulas de coníferas para asegurar un cultivo de vivero exitoso y en algunos casos, para la supervivencia de las plantas trasplantadas. De hecho, se ha demostrado que las zonas reforestadas con árboles micorrizados presentan mayores tasas de supervivencia y desarrollo que las zonas reforestadas con árboles sin micorrizar. En cambio, para algunas especies de hongos ECM comestibles, se ha logrado diseñar protocolos de producción de inóculo viable (Fase 1) y se ha conseguido la inoculación (Fase 2) exitosa en sus hospedadores, como es el caso de Tricholoma matsutake. Sin embargo, al trasladar la planta al campo (Fases 3 y 4), la micorriza inducida se perdía. De momento el único caso de protocolo exitoso hasta la fase 4, ha sido el cultivo de trufas (Tuber melanosporum y Tuber uncinatum) o de Lactarius deliciosus, resultando viable dos años después de plantar ejemplares de Pinus radiata colonizados con dicho micelio. El éxito alcanzado en estos cultivos ha propiciado el estudio de la producción de otros hongos ECM comestibles. En el caso de Boletus edulis complex (B. edulis Bull.:Fr. sensu stricto, B. aereus Bull.:Fr., B. pinophilus Pilat et Dermek y B. reticulatus Schaeff.) se han intentado diversos procedimientos para su micorrización. Por ejemplo, mediante la inoculación controlada en laboratorio (in vitro) y en maceta (ex vitro), e incluso, mediante otros métodos de inoculación ex vitro en condiciones no controladas en el campo, empleando fragmentos de carpóforos, esporas o micelio obtenido en el laboratorio. Sin embargo, ninguno de estos métodos aseguró la formación de carpóforos, probablemente debido a la pérdida del micelio del hongo, antes de que se llegase a establecer la formación de una micorriza funcional. Se evidencia por lo tanto una falta de conocimiento sobre la fenología y autoecología de los hongos ECM, particularmente de los comerciales, así como de sus requerimientos nutricionales y climáticos. Para alcanzar el éxito en el cultivo de hongos ECM, se requiere una investigación más profunda de los factores bióticos y abióticos que influyen en la preservación de la micorriza en campo, así como aquellos que inducen la fructificación de sus carpóforos. Como se ha comentado anteriormente, un factor biótico que podría estar afectando a la formación de la micorriza en campo y a la producción de carpóforos es la presencia o ausencia de otros microorganismos en la rizosfera de la planta. La acción de algunas bacterias y de otros hongos, por depredación o competencia, podrían estar impidiendo el crecimiento del micelio del hongo inoculado. Del mismo modo, la ausencia de ciertas MHB podría estar bloqueando la formación de ectomicorrizas. Recientemente, se han confirmado que la bacteria Pseudomonas fluorescens tiende a estimular la micorrización. Concretamente, la presencia de esta bacteria mejora la tasa de micorrización y estimula el crecimiento de ciertos hongos ectomicorrícicos en condiciones experimentales. También se ha descrito un aumento significativo de la fructificación de los carpóforos de Tuber melanosporum en Pinus halepensis en presencia de esta misma bacteria. Los factores climáticos afectan directamente a la aparición y producción de carpóforos. Se han observado correlaciones positivas con la temperatura y la cantidad de lluvia; sin embargo, las correlaciones no son siempre tan lineares y predecibles, necesitándose cierta cantidad de agua en el período previo a la fructificación, así como un rango de temperaturas apropiadas durante el desarrollo. En cuanto a los requerimientos edáficos, B. edulis prefiere suelos ácidos y permeables, con texturas arenosas y altos contenidos de materia orgánica y relaciones C/N. También se ha descubierto que algunos factores abióticos, como las horas de luz y las oscilaciones de la temperatura, podrían afectar negativamente a la capacidad de algunas plantas para mantener la micorrización de B. edulis en invernaderos bajo condiciones controladas. Otro factor abiótico importante en la formación estable de micorrizas es el balance de carbono en la simbiosis. Boletus generalmente se considera un hongo de etapa tardía, ya que produce carpóforos en rodales maduros, lo que sugiere altos requerimientos de suministro de carbono. Uno de los hospedadores por excelencia de B. edulis complex en Europa es el castaño (Castanea sativa Miller). El castaño europeo es un importante recurso económico para la comercialización de madera y frutos. Gracias a su clima templado y húmedo, muy adecuado para el cultivo del castaño, Galicia (NO de España) es el principal productor de castañas del país, estando estos frutos bajo la etiqueta de Indicación Geográfica Protegida (IGP). Según el Libro Blanco Europeo de la Castaña, los seis países europeos con mayor producción de castañas en 2017 fueron: Turquía (62.904 t), Italia (52.356 t), Grecia (36.000 t), Portugal (29.975 t), España (15.623 t) y Francia (8.406 t). Datos más recientes indican que España aumentó el número de producciones respecto a 2017, alcanzando las 26.759 toneladas en 2021, de las que Galicia produjo 11.200 toneladas. A pesar del notable descenso del cultivo del castaño desde principios del siglo XX debido a enfermedades como la tinta y al cancro, se ha producido un aumento de la superficie ocupada por esta especie en los últimos 30 años. Esto fue en parte gracias a los avances en el control de las enfermedades del castaño utilizando portainjertos resistentes. Actualmente, injertar castaño europeo en un clon híbrido euroasiático resistente a la enfermedad de la tinta es más la norma que la excepción. Esta Tesis Doctoral es fruto de un contrato de colaboración entre la empresa Hifas Foresta S.L. y el Grupo de Investigación Agrobiotech for Health de la Universidad de Vigo, lo que ha permitido optar a la Mención de Doctorado Industrial. Además, ha incluido una estancia predoctoral de 3 meses en la empresa portuguesa Deifil Technology Lda. en colaboración con el grupo BioChemCore del CIMO-IPB (Centro de Investigação de Montanha, Instituto Politécnico de Bragança, Portugal), lo que ha permitido optar a la Mención de Doctorado Internacional. Hifas Foresta S.L. cuenta con una amplia variedad de híbridos Castanea × coudercii (Castanea sativa x Castanea crenata) disponible al mercado. Como se explicó anteriormente, el uso de hongos ECM aumenta la resistencia a los patógenos y la mayoría de los éxitos en la micorrización del castaño han sido con especies de ECM sin interés comercial. La obtención de castaño micorrícico con miembros del complejo de B. edulis es de gran interés comercial si estas micorrizas se mantienen en el campo y se consigue un control de su fructificación. Por este motivo, el primer objetivo de esta tesis fue identificar los factores bióticos y abióticos que afectan la micorrización de Castanea × coudercii (Castanea sativa x Castanea crenata) con B. edulis y B. reticulatus en condiciones naturales. Para ello se persiguieron los siguientes tres objetivos específicos, que corresponden a los Capítulos I, II y III respectivamente: 1) Caracterizar la estructura ecológica de la comunidad fúngica ECM asociada a castaños híbridos injertados y no injertados y determinar la tasa de colonización de hongos ECM. 2) Investigar el impacto de factores bióticos (hongos y bacterias del suelo) sobre la frecuencia y concentración de micelio de B. edulis en huertos de Castanea × coudercii de diferentes edades. 3) Dilucidar el papel de los factores abióticos (suelo y clima) sobre la frecuencia y concentración de micelio extraradical de B. edulis y B. reticulatus, en parcelas de Castanea × coudercii de diferentes edades. El Capítulo I corresponde al artículo científico ¿Ectomycorrhizal fungal community structure in a young orchard of grafted and ungrafted hybrid chestnut saplings¿ publicado en la revista Mycorrhiza (Santolamazza-Carbone et al., 2021). En este trabajo se estudió la comunidad de hongos ECM de híbridos de castaño Castanea × coudercii de 2 años utilizando métodos moleculares. Mediante el uso de los clones híbridos de castaño 111 y 125, evaluamos el impacto del injerto en la tasa de micorrización, la diversidad de especies y la composición de la comunidad fúngica. El tipo de clon no tuvo impacto en las variables estudiadas; sin embargo, el injerto influyó significativamente en la tasa de colonización de hongos ECM en el clon 111. La diversidad y riqueza de especies no varió entre los grupos experimentales. Las plantas injertadas y no injertadas del clon 111 tenían una composición de especies de hongos ECM significativamente diferente. Los datos de secuencia de las regiones ITS de rDNA revelaron la presencia de 9 órdenes, 15 familias, 19 géneros y 27 especies de hongos ECM, la mayoría de ellos generalistas, y de etapa temprana. Se describieron trece taxones nuevos en asociación con los castaños. Los basidiomicetos Agaricales (13 taxones) y Boletales (11 taxones) representaron el 36% y el 31% del total de taxones de hongos ECM muestreados, respectivamente. Scleroderma citrinum, S. areolatum y S. polyrhizum (Boletales) se encontraron en el 86% de los árboles y representaron el 39% del total de puntas de raíces ECM. El ascomiceto Cenococcum geophilum (Mytilinidiales) se encontró en el 80% de los árboles, pero representó solo el 6% de los ápices micorrícicos. Estos resultados podrían ayudar a desvelar el impacto del injerto en los simbiontes fúngicos, mejorando la gestión de los ecosistemas agrícolas del castaño y la producción de especies fúngicas comestibles. El Capítulo II corresponde al artículo científico ¿Soil microbiota impact on Boletus edulis mycelium in chestnut orchards of different ages¿ publicado en la revista Applied Soil Ecology (Santolamazza-Carbone et al., 2023). En él se han investigado los factores bióticos (edad de la planta huésped y microbiota del suelo) que influyen en la frecuencia y concentración del micelio de B. edulis. El estudio se llevó a cabo durante los meses de septiembre, octubre y noviembre de 2018 y 2020, utilizando seis parcelas de castaño híbrido Castanea × coudercii de 40, 10 y 3 años. La identidad taxonómica de las especies bacterianas y fúngicas se determinó mediante metabarcoding. La frecuencia de micelio y la concentración de B. edulis se estudiaron mediante PCR cuantitativa (qPCR) de muestras de suelo. Se planteó la hipótesis de que las plantas maduras (40 años) tienen un mayor microbiota del suelo asociada a la rizosfera, en comparación con las plantas jóvenes (10 y 3 años). Esta situación puede repercutir en el micelio de B. edulis que debería ser más abundante en las parcelas de 40 años, también gracias al mayor número de interacciones beneficiosas con la comunidad de hongos y bacterias del suelo. Se encontró que la edad de la planta hospedante alteró significativamente la comunidad de bacterias y hongos en ambos años. La fracción bacteriana estuvo dominada por los filos Proteobacteria, Acidobacteria y Actinobacteria y mostró una mayor riqueza y diversidad de especies en las plantaciones de 10 y 3 años. El filo Basidiomycota fue más abundante en las plantaciones de 40 y 10 años, mientras que los filos Ascomycota y Mortierellomycota fueron más abundantes en las plantaciones de 10 y 3 años. La frecuencia de micelio de B. edulis en muestras de suelo fue mayor en 2020 (97 %) que en 2018 (19 %), aunque sin diferencias entre edad de planta y mes de muestreo en cada año. La concentración de micelio de B. edulis fue mayor en 2020 que en 2018 y en septiembre de 2020, mientras que la edad de la planta no tuvo ningún efecto. De 173 taxones bacterianos considerados, el 12 %, 54 % y 82 % de las correlaciones significativas con la concentración de micelio de B. edulis se encontraron en las plantaciones de 40, 10 y 3 años, respectivamente. Por otro lado, de 180 taxones fúngicos, el 12 %, 24 % y 42 % de las correlaciones significativas ocurrieron en las plantaciones de 40, 10 y 3 años, respectivamente. Esta investigación representa el primer informe sobre el papel de la microbiota del suelo en la ecología de B. edulis en el agroecosistema Castanea. El Capítulo III corresponde al borrador del artículo científico ¿Artificial intelligence unveils key interactions between soil properties and climate factors on Boletus edulis and B. reticulatus mycelium in chestnut orchards of different ages¿, sometido en la revista Frontiers in Soil Science. Aquí se determinó la posible interacción de dos importantes factores abióticos (suelo y clima) sobre la concentración y frecuencia micelial de B. edulis y B. reticulatus, utilizando estadísticas tradicionales y logaritmos de redes neuronales artificiales. Se determinó la concentración y frecuencia de micelio de Boletus durante tres meses (septiembre, octubre y noviembre), y dos años (2018 y 2020), en tres parcelas híbridas de castaño (Castanea × coudercii) de 40, 10 y 3 años, mediante qPCR. El análisis estadístico reveló un efecto significativo del año sobre la concentración de micelio de B. edulis y de la parcela de muestreo (diferente edad del árbol) sobre la frecuencia de B. reticulatus. La combinación de redes de inteligencia artificial (ANN) con lógica difusa, denominada lógica neurofuzzy (NF), permitió la construcción de dos modelos robustos. En el primero, utilizando año, mes y parcela de muestreo como entradas, NF identificó interacciones ocultas entre el año y el mes en la concentración de micelio de B. edulis, y de la parcela de muestreo y el mes de muestreo en la frecuencia de micelio de B. reticulatus, mejorando la información obtenida del análisis estadístico. En el segundo modelo, esos tres factores se desagregaron en 44 entradas, incluidas 20 propiedades del suelo y 24 elementos climáticos, y NF pudo seleccionar solo 8 factores críticos para explicar la variabilidad encontrada tanto en cuanto a la concentración y frecuencia micelial de ambas especies fúngicas. Específicamente, NF seleccionó dos propiedades químicas del suelo (capacidad de intercambio catiónico y carbono total) y tres propiedades físicas (macroagregados, porosidad total y capacidad de campo), así como sus interacciones con tres elementos climáticos (diferencia entre precipitación y evapotranspiración potencial, déficit hídrico acumulado en los dos meses anteriores y exceso de agua en el mes anterior al muestreo). En conjunto, estos resultados proporcionan una comprensión mucho más profunda y nuevos conocimientos sobre la ecología y el papel de los factores abióticos en el desarrollo del micelio de B. edulis y B. reticulatus en agroecosistemas de castaños. El segundo objetivo de esta tesis fue identificar los factores que afectan la micorrización de Castanea × coudercii con B. edulis en condiciones artificiales o controladas (in vitro). Para ello, se siguió el cuarto objetivo específico de la tesis en el Capítulo IV, que consistió en el diseño de protocolos de cultivo in vitro para la formación de ectomicorrizas en Castanea × coudercii. Se determinaron los factores clave (medios nutritivos y condiciones de cultivo) para el crecimiento in vitro del micelio de B. edulis y de B. reticulatus. Se estudió también el papel de los hongos ECM de etapa temprana Pisolithus arhizus, P. capsulifer y de la bacteria Pseudomonas fluorescens en la micorrización in vitro de B. edulis en explantes con y sin raíces de Castanea × coudercii. Concretamente, en este capítulo se caracterizaron todas las etapas in vitro de formación de ectomicorrizas de Boletus en híbridos de castaño. Se recolectaron en campo un total de 85 carpóforos del complejo B. edulis, de los cuales 49 fueron aptos y utilizados en la extracción de micelio. Fue posible aislar micelio de 23 de los carpóforos, sin embargo, algunas cepas perdieron fuerza con subcultivos sucesivos, por lo que este número disminuyó a 19 (9 de B. edulis y 10 de B. reticulatus). Los experimentos se realizaron durante la etapa de aislamiento, el establecimiento del micelio y la multiplicación in vitro del micelio. Para ello se evaluaron los siguientes factores que pueden afectar el crecimiento in vitro del micelio: a) especie, b) origen del carpóforo, c) temperatura de incubación, d) tiempo de cultivo, e) composición del medio de cultivo y f) co-cultivo con semillas de Brassica rapa. B. edulis y B. reticulatus mostraron preferencia por temperaturas de 20 y 25 ¿C. Los mayores crecimientos se obtuvieron a las 8 semanas, utilizando la especie B. edulis y el medio BAF. Finalmente, se indujeron micorrizaciones simples y dobles con B. edulis y Pisolithus arhizus o P. capsulifer en explantes con y sin raíz de híbridos de castaño. También se estudió si la adición de la bacteria Pseudomonas fluorescens era beneficiosa. En general, los explantes enraizados desarrollaron nuevas raíces y los explantes sin raíces desarrollaron raíces durante la inoculación. Se pudo confirmar la formación exitosa de ectomicorrizas en explantes enraizados y no enraizados. En general, los mejores resultados se obtuvieron con la doble micorrización con B. edulis y P. arhizus, mientras que la bacteria Pseudomonas fluorescens no mostró una ventaja en la formación de ectomicorrizas.