Aislamiento y caracterización de bacterias de pinares para la biodegradación de seda de procesionaria del pino

  1. Alba Díez Galán
Supervised by:
  1. Juan José Rubio Coque Director
  2. Rebeca Cobos Román Director

Defence university: Universidad de León

Fecha de defensa: 28 April 2023

Committee:
  1. Jesús Manuel Cantoral Fernández Chair
  2. Marcia Barquero Quirós Secretary
  3. Julio Javier Díez Casero Committee member
Department:
  1. BIOLOGÍA MOLECULAR

Type: Thesis

Abstract

La oruga de la procesionaria del pino Thaumetopoea pityocampa (OPP) está considerada como la especie más devastadora que produce la defoliación de los bosques mediterráneos de coníferas. Durante los meses fríos del año, la forma larvaria de este lepidóptero forma unos bolsones de seda en la parte apical del árbol. Su actividad se desarrolla durante el periodo de oscuridad, momento en el que abandonan el bolsón para alimentarse de las acículas de los pinos. Mientras que la seda producida por el gusano de seda Bombyx mori es uno de los polímeros de proteínas de origen natural más estudiados, poco se conoce de la estructura, composición y características de la seda generada por la OPP. A lo largo de este trabajo se ha realizado un estudio de la seda de T. pityocampa a nivel estructural y de su composición de aminoácidos. Mediante visualización por microscopía electrónica de barrido (MEB) y de transmisión (MET) se ha comprobado que la seda de la procesionaria del pino está formada por dos haces paralelos de fibroína recubiertos y unidos mediante una proteína distinta, posiblemente sericina. Mediante una hidrólisis ácida de la seda y cromatografía líquida de alta resolución se ha comprobado que los aminoácidos más abundantes son glicina, serina, alanina y ácido aspártico. A partir de bolsones de procesionaria del pino se aislaron dos especies bacterianas con capacidad de biodegradación de seda: Pseudomonas aeruginosa IIVV-SD1 y Bacillus licheniformis IIVV-SD3. Se secuenciaron los genomas de ambos aislados y se analizó in sílico la presencia de proteasas localizadas extracelularmente, o asociadas a la pared celular, que pudieran estar implicadas en la biodegradación de seda. En el caso de P. aeruginosa se seleccionó la elastasa o pseudolisina, una metaloendopeptidasa extracelular o proteína LasB como una candidata con alta probabilidad de estar implicada en la biodegradación de seda. De manera similar y a partir del análisis del genoma de B. licheniformis, se seleccionó la subtilisina Carlsberg, una serín endopeptidasa, también con localización extracelular, como proteasa posiblemente implicada en la biodegradación de seda. Seguidamente se realizaron ensayos de degradación de seda con la elastasa porcina y subtilisina comerciales y se comprobó que ambas proteasas eran capaces de degradar seda in vitro, siendo la subtilisina de B. licheniformis la que exhibió una mayor tasa de degradación de la seda. En el genoma de P. aeruginosa IIVV-SD1 se localizó el gen lasB, que codifica para la elastasa LasB, y se realizó un ensayo de sobreexpresión heteróloga en la cepa de E. coli BL21(DE3) para evaluar su papel en la degradación de seda de procesionaria del pino. La sobreexpresión de la proteína LasB a partir de la clonación del gen lasB en el vector de expresión pET SUMO y su posterior purificación por cromatografía de afinidad permitió observar degradación de seda por parte de la proteína purificada. Del mismo modo, se localizó en el genoma de B. licheniformis IIVV-SD3 el gen subC que codifica para la proteína subtilisina Carlsberg y se clonó en el plásmido pHY300PLK para la sobreexpresión homóloga de la proteína de B. licheniformis IIVVSD3. Por electroporación se obtuvieron dos transformantes, nombrados B1 y B2, y se realizaron ensayos de degradación de seda con ambos transformantes y en paralelo con la cepa silvestre B. licheniformis IIVV-SD3. De este modo se comprobó que los transformantes eran capaces de degradar seda con una mayor velocidad y eficiencia que la cepa silvestre. Para comprobar el número de copias del gen subC presentes en los transformantes B1 y B2 se realizó una PCR cuantitativa del gen subC, que permitió comprobar que los transformantes contenían 7 veces más copias del gen subC que el tipo silvestre B. licheniformis IIVV-SD3. De esta manera se demostró de forma inequívoca la participación de la elastasa LasB de P. aeruginosa IIVV-SD1 y la subtilisina SubC de B. licheniformis IIVV-SD3 en la degradación de seda de procesionaria del pino. Por último, se analizó la capacidad antifúngica de las cepas aisladas frente al hongo Fusarium circinatum, causante de una de las enfermedades más importantes en el género Pinus, con el fin de aumentar el valor de los aislados como posibles agentes de control biológico frente a enfermedades del pino. Aunque en un primer enfrentamiento entre B. licheniformis y F. circinatum la bacteria mostró cierta actividad antifúngica, los resultados no fueron significativos en posteriores ensayos. Sin embargo, P. aeruginosa resultó tener gran actividad antifúngica frente a F. circinatum pudiendo inhibir su crecimiento, a los 7 días, un 51,50% respecto al crecimiento del hongo control. Los resultados obtenidos en la presente Tesis Doctoral han permitido dilucidar la estructura y composición de la seda de la procesionaria del pino, así como el aislamiento de microorganismos cuyas proteasas están implicadas en la biodegradación de los materiales de seda. Se trata de un hallazgo que podría dar lugar a posibles aplicaciones para el control de esta plaga y tal vez tener importancia desde un punto de vista sanitario y biotecnológico.