Estudio de la degradación de esteroides en Novosphingobium tardaugens NBRC 16725 y sus aplicaciones biotecnológicas

Resumen

Los esteroides presentan una gran distribución en la naturaleza y son relevantes por su implicación en enfermedades infecciosas, por ser de los medicamentos más producidos y porque su presencia puede suponer un riesgo medio ambiental. Dentro de estos compuestos destacan los estrógenos, hormonas esteroideas, por su alta toxicidad a bajas concentraciones y su creciente presencia en diferentes nichos ecológicos. Dada la relevancia de la degradación bacteriana en la eliminación de estrógenos y la limitada información disponible sobre el metabolismo del colesterol (CHO) en bacterias Gram- negativas, se propusieron los siguientes objetivos, utilizando la bacteria Novosphingobium tardaugens NBRC 16725: desarrollo de herramientas genómicas para su uso como modelo; caracterización de la ruta de degradación bacteriana aeróbica de esteroides C19, esteroides con cadena lateral y de estrógenos y de su regulación transcripcional; y desarrollo de aplicaciones biotecnológicas. Un estudio comparativo del genoma de N. tardaugens ha revelado la existencia del clúster de genes SD, similar al clúster de genes de degradación de testosterona (TES) en C. testosteroni TA441, que ha permitido asignar una función a cada uno en la ruta de degradación de TES. Se han ensayado dos enzimas 3/17beta-HSD, Hsd60 y Hsd70, que presentan actividad deshidrogenasa sobre TES, estradiol (E2), DHEA y pregnenolona. El transcriptoma de N. tardaugens cultivada en E2 reveló la inducción específica del clúster edc. La mutagénesis de la región promotora, de los dos operones del clúster y de 3 genes concretos mostró su función específica para el metabolismo del E2. Los ensayos enzimáticos demostraron que el citocromo P450 EdcA, tiene actividad estrona 4- hidroxilasa. El estudio de la regulación transcripcional de la ruta de degradación del E2 ha revelado la existencia de un represor, EdcR, que reprime la expresión de los genes del cluster edc y responde específicamente a estrona (E1) y E2, que actúan como inductores. Se ha diseñado un biosensor en Escherichia coli que permite detectar la presencia de E1 y E2. Se ha demostrado que la cepa acumula polihidroxialcanoatos en forma de copolímero de polihidroxibutirato y polihidroxivalerato, utilizando esteroides como única fuente de carbono. El transcriptoma de la cepa cultivada en CHO ha servido para identificar varios clústeres de genes inducidos. Dentro del clúster cdc, se codifica un citocromo CYP450 que se ha demostrado ser esencial para el crecimiento de N. tardaugens en CHO. El trabajo recogido en la presente Tesis Doctoral ha dado lugar a las siguientes conclusiones principales: N. tardaugens es capaz de crecer utilizando como fuentes de carbono y energía una gran variedad de esteroides, incluido el CHO, un sustrato muy poco frecuente en bacterias Gram-negativas; se han desarrollado herramientas moleculares en N. tardaugens que han permitido realizar modificaciones en su genoma; mediante una combinación de análisis ómicos y bioquímicos se han identificado los clústeres génicos SD y edc, de metabolismo de esteroides C-19 y estrógenos, respectivamente; se ha demostrado que el primer paso en la ruta de degradación de la E1 en N. tardaugens está catalizado por un citocromo P450, EdcA; se ha demostrado que la proteína EdcR, interviene como represor transcripcional del clúster edc en N. tardaugens siendo su principal inductor la E1 y, en menor medida, el E2; el conocimiento adquirido sobre la regulación transcripcional ha permitido diseñar un biosensor que responde a estrógenos; mediante un análisis transcriptómico se han identificado los genes implicados en el metabolismo de los ácidos biliares en N. tardaugens ; se ha demostrado la existencia de un clúster de genes que codifica un citocromo P450, esencial para la utilización del colesterol como fuente de carbono y energía en N. tardaugens; y se ha demostrado la capacidad de N. tardaugens para acumular PHAs utilizando los esteroides como fuentes de carbono y energía.