Construccion de cepas de levaduras superproductoras de treonina mediante tecnicas de ingenieria genetica molecular

Resumen

El fin ultimo de esta tesis ha sido la obtencion de cepas de sacchromyces cerevisiae que superproduzcan treonina. Se trataba de probar si la amplificacion de algunos genes implicados en la biosintesis de este aminoacido redundaba en la acumulacion del mismo. Para ello se construirian plasmidos multicopia que contuviesen los genes en cuestion y se introducirian en cepas de s. Cerevisiae con distintos fondos geneticos. Esta estrategia tendria la ventaja respecto de las clasicas de mutagenesis y seleccion, de minimizar los cambios que se provocan en el organismo como consecuencia de la manipulacion genetica del mismo. El estudio se ha centrado en genes que determinan enzimas claves de la regulacion de la ruta de sintesis de treonina en levaduras, concretamente hom3 y thr1. El gen hom3 determina la aspartato quinasa que cataliza el primer paso de la ruta comun de sintesis de metionina y treonina. La amplificacion de este gen en un fondo genetico esencialmente silvestre hace que la celula acumule 10 veces mas treonina que la cepa silvestre y una gran cantidad de homoserina, intermediario de la ruta. El alelo silvestre hom3 ha servido de base para la clonacion del mutante homo-r2 que determina una aspartato quinasa insensible a retroinhibicion por treonina. La clonacion se ha llevado a cabo mediante el metodo de rescate alelico basado en la reparacion de "huecos" en el adn. Una cepa de levaduras que contiene un alto numero de copias de este alelo mutante, acumula unas 50 veces mas treonina que la cepa silvestre, y aun mas homoserina. Por complementacion se ha asilado el gen thr1 de s. Cerevisiae, que determina la homoserina quinasa. Esta enzima es la responsable de la transformacion de homoserina en homoserina fosfato, primer paso de la ruta especifica de la treonina. La amplificacion de este gen tiene un efecto distinto dependiendo del fondo genetico de la cepa. Asi, mientras que la amplificacion en un fondo genetico sil