Application of molecular techniques to the diagnosis and epidemiology of Haemophilus parasuis

Resumen

Haemophilus parasuis es lagent etiológic de la malaltia de Glässers, però aquesta bactèria pot causar altres manifestacions clíniques, a més a més de poder ser aïllat del tracte respiratori superior de porcs sans. Els aïllaments de H. parasuis poden presentar diferents fenotips (per exemple diferent perfil de proteïnes, morfologia de colònia o bé producció de càpsula) i diferent capacitat patogènica. Les diferencies entre soques també shan demostrat a nivell genètic. Shan emprat varis mètodes de tipat per classificar soques de camp d H. parasuis, però totes presentaven problemes de resolució o implementació. Per resoldre aquestes limitacions es van avaluar diferents tècniques basades en seqüenciació dADN. Conseqüentment lobjectiu daquest estudi fou millorar el tipat d H. parasuis i examinar lassociació entre grups de soques i aparició de malaltia. En el primer capítol daquest treball sestudià lús duna seqüència parcial del gen heat shock protein 60 KDa (hsp60) com a marcador epidemiológic en un esquema de single locus sequence typing (SLST). Es compararen els resultats obtinguts emprant patrons de enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR, seqüències parcials de hsp60 i 16S rARN de 103 soques d H. parasuis i altres espècies relacionades. En el segon capítol daquest treball es va desenvolupar un esquema de multilocus sequence typing (MLST) fent servir seqüències parcial del gens house-keeping mdh, 6pgd, atpD, g3pd, frdB, infB and rpoB. Onze soques de referència i 120 soques de camp van ser incloses en aquest darrer estudi. Els nostres resultats mostren que la hsp60 es un marcador fiable per estudis epidemiológics d H. parasuis, i que lanàlisi daquesta seqüència es una aproximació millor que els mètodes basats en patrons de bandes. Sorprenentment els gen 16S rARN mostrà prou variabilitat com per ser emprat en el tipatge de H. parasuis enlloc de només en la identificació a nivell despècie. A més a més, lanàlisi de les seqüències de hsp60 i 16S rARN revelaren lexistència de un llinatge divergent de soques associades a laparició de malaltia. Ambdós estudis, un amb SLST i laltre amb MLST, indicaren lexistència de transferències laterals de gens entre soques de H. parasuis i Actinobacillus invalidant lús daproximacions basades en un sol gen en lanàlisi filogenètic daquesta espècie. Lanàlisi amb MLST mostrà lexistència de 6 clusters. Quan sexamina lorigen clínic dels aïllaments es veié que un dels clusters estava estadísticament associat amb laïllament nasal mentre que un altre era associat amb laïllament de lesions. El darrer cluster incloïa les mateixes soques que el llinatge associat amb laparició de malaltia prèviament descrit amb els gens hsp60 i 16S rARN. Finalment, tot i que H. parasuis presenta una estructura de població lliurement recombinant es van trobar dues branques divergents en construir un arbre neighbour-joining amb les seqüències del MLST concatenades. Aquesta troballa dona suport als resultats obtinguts amb el gen 16S rARN indicant que H. parasuis sembla tenir una especiació críptica enlloc de una estructura de població panmíctica. Haemophilus parasuis is the etiological agent of Glässers disease, but this bacterium causes other clinical outcomes and can also be isolated from the upper respiratory tract of healthy pigs. Isolates of H. parasuis differ in phenotypic features (e.g. protein profiles, colony morphology or capsule production) and pathogenic capacity. Differences among strains have also been demonstrated at the genetic level. Several typing methods have been used to classify H. parasuis field strains, but they showed resolution or implementation problems. To overcome these limitations, different DNA sequence based techniques were evaluated. Consequently, the final goal of this study was to improve H. parasuis typing and examine the association of groups of strains with disease outcome. In the first chapter of this work, a partial sequence from the heat shock protein 60 KDa (hsp60) gene was assessed as epidemiological marker in a single locus sequence typing (SLST). We compared enterobacterial repetitive intergenic consensus (ERIC)-PCR patterns, partial sequences of hsp60 and 16S rRNA genes from 103 strains of H. parasuis and other related species. In the second chapter of this work, we developed a multilocus sequence typing (MLST) system using partial sequences of the house-keeping genes mdh, 6pgd, atpD, g3pd, frdB, infB and rpoB. Eleven reference strains and 120 field strains were included in this latter study. Our results showed that hsp60 is a reliable marker for epidemiological studies in H. parasuis, and the analysis of its sequence is a better approach than fingerprinting methods. Surprisingly, the 16S rRNA gene showed enough variability to be used, not only for species identification, but also for typing. Furthermore, the analysis of the hsp60 and 16S rRNA sequences revealed the presence of a separated lineage of disease-associated strains. Both SLST and MLST studies indicated the occurrence of lateral gene transfer among H. parasuis and Actinobacillus strains invalidating the use of single gene approaches in the phylogenetic analysis of these species. MLST analysis revealed the existence of 6 clusters. When the clinical background of the isolates was examined, one cluster was statistically associated with nasal isolation, while another cluster was associated with isolation from lesions. The latter cluster was the same disease-associated cluster identified by hsp60 and 16S rRNA gene analysis. Finally, although a freely recombining population structure was reported, two divergent branches were found when a neighbour-joining tree was constructed with the concatenated sequences. The latter, supports the results obtained by 16S rRNA gene sequencing and indicate that H. parasuis is more likely to have a cryptic speciation than a true panmictic population structure.