Caracterización de ZmXTH1, una nueva xiloglucano endotraglucosilasa-hidrolasa en maiz

Resumen

En este trabajo se ha caracterizado una proteína de la pared celular de maíz, una xiloglucano endotransglucosilasa-hidrolasa, denominada ZmXTH1. Esta clase de enzimas actúa sobre los polisacáridos de la pared celular primaria, favoreciendo procesos como la expansión y el crecimiento de la célula vegetal. El clon de cDNA fue aislado mediante un cribado de una librería de expresión de cDNA de la zona de elongación de la raíz de maíz con anticuerpos producidos contra una fracción enriquecida en proteínas de pared. La búsqueda en base de datos de otras secuencias codificantes (ESTs) de maíz ha permitido la identificación de varias XTHs putativas en esta especie. En maíz, por lo tanto, las XTHs pertenecen a familias multigénicas, así como ocurre en dicotiledóneas y en otras monocotiledóneas gramíneas como arroz y cebada. Este dato sugiere que las XTHs de gramíneas tienen en un papel tan importante como en las dicotiledóneas, a pesar de que los xiloglucanos representan un componente minoritario de la pared celular en gramíneas. El estudio filogenético de ZmXTH1 revela que esta proteína pertenece a un subgrupo filogenético minoritario, el subgrupo 4, que agrupa sólo XTHs ácidas y de gramíneas. Los componentes de este subgrupo presentan algunas características peculiares a nivel de estructura aminoacídica, como el dominio catalítico. Los estudios de expresión espacial y temporal efectuados con las XTHs de la familia multigénica de maíz indican que, así como se ha demostrado para otras familias multigénicas de XTHs, los miembros de esta familia exhiben patrones de expresión distintos y están ampliamente expresados en todos los estadios de desarrollo y en todos los órganos de la planta. Esto sugiere que en maíz, así como sucede en otras especies vegetales, estas proteínas participan en fenómenos morfo-genéticos en todo el ciclo vital de la planta. La expresión preferencial de ZmXTH1 en órganos de plantas jóvenes, en activa elongación y crecimiento, así como su inducción por giberelinas apoya la hipótesis de que la función de ZmXTH1 está relacionada con fenómenos de crecimiento y elongación. Para abordar la caracterización enzimática de ZmXTH1 se ha producido la proteína recombinante tanto en la bacteria E.coli como en la levadura P.pastoris. Los ensayos de actividad XET indican que esta proteína actúa como una xiloglucanoendotransglucosilasa, ya que presenta actividad enzimática XET cuando es expresada en P.pastoris. La actividad XET resulta ser la única actividad que presenta esta proteína, ya que no presenta afinidad para otros sustratos diferentes del xiloglucano, incluidos sustratos que son componentes mayoritarios de la pared celular de maíz. La proteína expresada en E.coli no presenta ningún tipo de actividad. Esto puede ser debido a la ausencia de modificaciones post-traduccionales o a una mala renaturalización de la proteína. Los estudios de localización subcelular indican que el péptido señal de ZmXTH1 es Funcional, ya que dirige la proteína a la ruta de secreción para enviarla al apoplasto. Se ha demostrado la localización de ZmXTH1 en pared en el sistema heterólogo de cebolla. Además su presencia en los fluidos apoplásticos de maíz, junto con los ensayos de plasmolisis de cebolla así como su carácter ácido, sugieren que ZmXTH1 es una proteína apoplástica débilmente asociada a la pared celular. Los análisis funcionales de ZmXTH1, mediante su expresión en Arabidopsis thaliana, indican que ZmXTH1 actúa en la pared celular. Los análisis funcionales de ZmXTH1, mediante su expresión en Arabidopsis thaliana, indican que ZmXTH1 actúa en la pared celular. De hecho, las plantas transgénicas presentan un ensanchamiento a nivel de la pared celular primaria y de la lamina media, sugiriendo, en su conjunto, un rol de ZmXTH1 en el proceso de wall loosening en maíz. "ENGLISH SUMMARY: Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolases (XTHs) are enzymes involved in the modification of cell wall structure by cleaving and often also re-joining xyloglucan molecules in primary plant cell walls. Using a pool of antibodies raised against an enriched cell wall protein fraction, we have isolated a new XTH cDNA in maize, ZmXTH1, from a cDNA expression library obtained from the elongation zone of the maize root. The presumably full-length cDNA is 1,225 bp long; the predicted protein has 281 amino acids and possesses the typical domains of this enzyme family, such as a putative N terminal transmembrane domain, a catalytic domain that is homologous to that of Bacillus beta-glucanase, a putative N-glycosylation motif and four cysteine residues in the central and C terminal regions of the ZmXTH1 protein. Phylogenetic analysis of ZmXTH1 reveals that it belongs to the small subgroup four, so far only reported from monocot species. The ZmXTH1 has been expressed in Pichia pastoris at low levels; the recombinant enzyme showed XET (xyloglucan endotransglucosylase) activity and represents the first enzyme belonging to subgroup four characterised in maize. Expression data indicate that ZmXTH1 is expressed in elongating tissues, modulated by culture conditions and induced by gibberellins. Finally, transient expression assays in onion cells reveal that ZmXTH1 is directed to the cell wall and its expression in Arabidopsis thaliana produces modifications in the primary cell walls. "