Ruminal degradation of proteinimplications for polluting emissions

Resumen

Los rumiantes contribuyen a la emisión de gases de efecto invernadero, principalmente a través del metano (CH4) producido por la fermentación ruminal, que tiene un efecto invernadero entre 21 y 25 veces más potente que el CO2. Por esta razón, en los últimos años se han desarrollado numerosas investigaciones que se han centrado en el análisis de los factores dietéticos que afectan a la producción de este gas, si bien apenas se ha investigado el efecto de las características de las fuentes de nitrógeno. Con este trabajo se pretende, además de estudiar estos efectos, ampliar el conocimiento sobre los alimentos proteicos, estudiando un aspecto poco conocido como es la degradación de los compuestos nitrogenados asociados con las paredes celulares de los alimentos de origen vegetal. La tesis consta de cuatro experimentos: Experimento 1. El objetivo de este experimento fue analizar la degradación ruminal de las fracciones NDIN y ADIN en muestras de alimentos y comparar los resultados obtenidos con la técnica de dilución del 15N cuando se corrigen para la contribución de las bacterias asociadas a la fase sólida con los valores obtenidos sin corregir. Se utilizaron muestras de semillas de girasol (SS), grano de trigo (WG) y paja de trigo (WS) obtenidas a partir de cultivos fertilizados con 15N para aumentar su abundancia. Estos tres alimentos se seleccionaron debido a que muestran una amplia gama de las fracciones FND, FAD, NDIN y ADIN. Se utilizaron tres ovejas Talaverana provistas con cánulas ruminales, alimentadas con una dieta mixta de heno de alfalfa y concentrado (en relación 2:1 en materia fresca). Las incubaciones ruminales se realizaron con bolsas de nylon que contenían aproximadamente 3 g de cada alimento, que se incubaron en el rumen de cada oveja en dos series de incubaciones durante 4, 24, 48 y 72 horas. A partir de estas incubaciones se determinó la desaparición de materia seca (MS), N-total, FND, FAD, NDIN y ADIN, ajustándose las cinéticas para cada animal a un modelo exponencial simple. Para las fracciones N-total, NDIN y ADIN se establecieron las cinéticas de degradación con el mismo modelo, corregidas para la contaminación microbiana. Los valores de abundancia en 15N para N-total y NDIN fueron similares, mientras que para ADIN disminuyeron (1,28, 9,95 y 9,24% de reducción en SS, WG y WS, respectivamente). Este hecho sugiere una contaminación con N (a partir del bromuro de cetil-trimetil amonio) en el proceso de aislamiento de la FAD y por tanto una sobrevaloración del ADIN que probablemente sería función de la polaridad de la fibra. Los procedimientos de aislamiento de FND y FAD no eliminan una gran parte de los microorganismos adheridos al alimento durante la incubación ruminal, lo que implica infravalorar la degradabilidad efectiva del NDIN y ADIN si esta contaminación no se considera. Los resultados corregidos por la contaminación microbiana también muestran una contribución considerable del NDIN al N-total degradado (7,25, 13,7 y 20,3% en SS, WG y WS, respectivamente), mientras que para el ADIN solo alcanza cierta importancia en los alimentos fibrosos (2,69, 0,27 y 7,25% en SS, WG y WS, respectivamente). Experimento 2. El objetivo de este experimento fue analizar la contribución de la fermentación de la proteína a la producción de CH4 in vitro, así como investigar su influencia en la fermentación de dos sustratos de diferente composición. Para ello se utilizó fluido ruminal obtenido de cuatro ovejas fistuladas en el rumen y alimentadas con una dieta mixta 2:1 de heno de alfalfa y un concentrado comercial. Se utilizaron dos sustratos puros con diferente velocidad de fermentación, formados por mezclas de almidón y celulosa en proporciones 75:25 y 25:75 (STAR y CEL, respectivamente) y tres fuentes de N: NH4Cl (N no proteico; NNP), caseína (CA) y proteína de soja (SP). Las incubaciones se llevaron a cabo con cultivos discontinuos de microorganismos ruminales para evaluar el efecto de la sustitución (0, 50 y 100%) del NNP por N proteico en la producción in vitro de CH4 y en la fermentación de los sustratos. La cantidad de N aplicada en cada tratamiento fue de 35 mg N/g de materia orgánica de sustrato y las incubaciones duraron 16,5 h. Con ambas proteínas, se detectaron interacciones fuente N x sustrato (p = 0,065 a 0,002) para la producción de CH4 y la relación CH4/ácidos grasos volátiles (AGV). Los aumentos en la producción de CH4 debidos a la sustitución de NNP por N proteico fueron mayores (P < 0,05) para el sustrato STAR que con el sustrato CEL; por el contrario, la producción de AGV totales fue mayor con CEL que con STAR. El aumento del nivel de sustitución del NNP por CA o SP dio lugar a variaciones lineales en la relación CH4/AGV, que aumentó con el sustrato STAR y tendió (P < 0.10) a reducirse con el sustrato CEL. La concentración de NH3-N disminuyó con el suministro de cantidades crecientes de ambas proteínas, lo que podría indicar una incorporación directa de aminoácidos y péptidos en la proteína microbiana con una consiguiente reducción de la desaminación. En incubaciones con las fuentes de N como único sustrato, la fermentación de 1 mg de CA o SP produjo 1,24 y 0,60 ?mol de CH4, respectivamente. Los resultados indican que la generación de CH4 debido de la fermentación de las proteínas y que puede diferir con el sustrato basal. Experimento 3. El objetivo de este estudio fue analizar el efecto del tratamiento de la harina de girasol (SM) y la semilla de girasol (SS) con ácido málico y calor a 150°C durante 1 (MAL1) o 3 horas (MAL3) en la fermentación ruminal in vitro y la emisión de CH4. Se realizaron 2 incubaciones in vitro diferentes utilizando fluido ruminal obtenido de 4 ovejas fistuladas en el rumen y alimentadas con una dieta mixta 2:1 de heno de alfalfa y un concentrado comercial. En la primera incubación se evaluó la cinética de producción de gas hasta 144 h y en la segunda se determinaron los principales parámetros de la fermentación a las 16,5 h. El tratamiento MAL1 causó pequeños cambios en los contenidos de PB, FND, FAD y LAD en los dos alimentos, posiblemente debidos al efecto de dilución asociado con la adición de ácido málico en el tratamiento de protección. Este tratamiento no tuvo efectos negativos sobre la producción de gas, pero redujo significativamente los valores de la degradabilidad efectiva de la materia seca en SS (20,3%) y de forma numérica en SM (3,6%) debido a una moderada ralentización de su fermentación, lo que implicaría un cambio del lugar de digestión del rumen al intestino. Así mismo, este tratamiento fue efectivo en la protección de la proteína, como lo indica la reducción de las concentraciones de NH3-N en SS (26,5%) y SM (14,5%) respecto a las muestras sin tratar. Además, el tratamiento MAL1 no aumentó la concentración de ADIN en SS o SM, lo que indicaría que no produjo daño en sus proteínas. Esta protección de la proteína se asoció con reducciones de la producción de CH4 (15,5% y 11,3% para SS y SM, respectivamente), en la proporción de CH4 en el gas producido y en las relaciones CH4/AGV totales y acetato/propionato, evidenciando todo ello una clara mejora de la eficacia de fermentación. Por el contrario, el tratamiento MAL3 condujo a una sobreprotección, asociada a una importante reducción del valor nutritivo como lo demuestran los incrementos observados en los contenidos en fibra neutro detergente, fibra ácido detergente, lignina, NDIN y ADIN, así como la reducción en la producción de gas, la degradabilidad efectiva y la producción de AGV en comparación con los valores observados en las muestras sin tratar. Experimento 4. En este experimento se comparó el efecto del tratamiento con ácido málico y calor a 150°C durante 1 h de SS y SM con el uso como aditivo de la misma dosis de ácido málico o de su sal disódica en la fermentación ruminal in vitro y la producción de CH4 a 6 y 16,5 h. Así mismo se estudió el efecto del tipo de inóculo microbiano, que fue obtenido de las cuatro ovejas fistuladas en el rumen utilizadas en el experimento anterior. Las ovejas recibieron dos dietas mixtas formadas por heno y concentrado en relación 50:50 (MC) y por paja de cebada y concentrado en relación 15:85 (HC). Estas dietas se consideraron representativas de las utilizadas en rumiantes en lactación y en los sistemas intensivos de producción de carne, respectivamente. El tratamiento de protección se mostró más efectivo que en el experimento anterior pese a haberse utilizado la misma muestra de SS y SM. Así, las reducciones medias de la producción de metano a las 16,5 h fueron 60,3% en SS y 26,7% en SM y en las concentraciones de NH3-N fueron el 45,3% y 17,2% para SS y SM, respectivamente. Además, se observó también una relación positiva altamente significativa (P < 0,001) entre las concentraciones de NH3-N y CH4 en los dos tiempos de incubación y en ambos alimentos. El tratamiento produjo también otras mejoras de la eficacia de fermentación como la reducción de las relaciones CH4/AGV totales y acetato/propionato. El uso como aditivo de la misma dosis de ácido málico o su sal sódica presentó algunos efectos positivos en la fermentación, pero éstos fueron más reducidos que los efectos del tratamiento de protección. Para algunos parámetros fermentativos, los efectos del tratamiento de protección fueron más marcados con el inóculo HC que con el inóculo MC. ABSTRACT Ruminants contribute to the emission of greenhouse gases mainly through the methane (CH4) produced by rumen fermentation, that has a greenhouse effect between 21 and 25 times more potent than CO2. For this reason, in recent years a lot of research has focused on the analysis of the dietary factors affecting the production of CH4, although little is known on the effects of the characteristics of the nitrogen sources. In this work some of these effects are studied and additionally the degradation of the nitrogen compounds associated with the cell wall was investigated in three different feeds. The thesis consists of four experiments. Experiment 1. The aim of this study was to determine the rumen degradation of the NDIN and ADIN fractions in several feeds and to compare the results obtained with the 15N dilution technique either corrected for the contribution of the solid-associated bacteria or uncorrected. Samples of sunflower seed (SS), wheat grain (WG) and wheat straw (WS) obtained from crops fertilized with 15N were used. These three feeds were selected because they show a large range of NDF, ADF, NDIN and ADIN contents. Three Talaverana sheep provided with ruminal cannulae were fed a mixed diet of lucerne hay and concentrate (in relation 2:1 on fresh matter). Ruminal incubations were performed with nylon bags containing approximately 3 g of each feed, which were incubated in the rumen of each sheep in two series of incubations for periods of 4, 24, 48 and 72 hours. The DM, total-N, NDF, ADF, NDIN, and ADIN disappearances were determined by adjusting the values for each animal to a simple exponential model. For N-total, NDIN and ADIN fractions, the same model was used and values were corrected for microbial contamination. The values of 15N abundance for total-N and NDIN were similar, whereas those for ADIN were lower (1.28, 9.95 and 9.24% for SS, WG and WS, respectively). This fact suggests a contamination with N (from cetyl trimethyl ammonium bromide) in the process of isolation of the ADF, and therefore an overestimation of ADIN that would probably be function of the polarity of the fibre. The procedures for NDF and ADF isolation do not remove a large fraction of adherent microorganisms, which results in an underestimation of the effective degradability of NDIN and ADIN when this contamination is not considered. The results corrected for microbial contamination showed a considerable contribution of the NDIN to the total-N degraded (7.25, 13.7 and 20.3% in SS, WG and WS, respectively), whereas for ADIN this contribution had only some importance for fibrous feeds (2.69, 0.27 and 7.25% in SS, WG and WS, respectively). Experiment 2. The objective of this experiment was to investigate the contribution of protein fermentation to in vitro CH4 production, and to assess its influence on the fermentation of two pure substrates composed by carbohydrates of variable fermentation rate. In vitro incubations were carried out with batch cultures of ruminal micro-organisms from sheep fed a 2:1 mixed diet of lucerne hay and a commercial concentrate. The two substrates were mixtures of maize starch and cellulose in proportions of 75:25 and 25:75 (STAR and CEL, respectively), and the three nitrogen (N) sources were: NH4Cl (non protein N; NPN), casein (CA) and isolated soybean protein (SP). Five isonitrogenous treatments were made by replacing non protein N (NPN) with CA or SP at levels of 0 (NPN), 50 (CA50 and SP50, respectively) and 100% (CA100 and SP100) of total N. All N treatments were applied at a rate of 35 mg of N/g of substrate organic matter and incubations lasted 16.5 h. With both proteins, N source x substrate interactions (P = 0.065 to 0.002) were detected for CH4 production and CH4/total volatile fatty acid (VFA) ratio. The increases of CH4 production observed by replacing the NPN with protein-N were higher (P < 0.05) for STAR than for CEL substrate, but the opposite was observed for the increases in VFA production. As a consequence, replacing the NPN by increased levels of CA or SP led to linear increases of CH4/total VFA ratio with STAR, whereas CH4/total VFA ratio tended (P < 0.10) to be decreased with CEL substrate. Increasing the amount of both proteins decreased linearly ammonia-N concentrations, which may indicate an incorporation of amino acids and peptides into microbial protein without being deaminated into ammonia-N. In incubations with the tested N sources as the only substrate, the fermentation of one mg of CA or SP produced 1.24 and 0.60 ?mol of CH4, respectively. The results indicate the generation of CH4 from protein fermentation may differ with the basal substrate. Experiment 3. The objective of this study was to analyse the effects of the treatment of sunflower meal (SM) and sunflower seed (SS) with malic acid and heat at 150ºC for 1 (MAL1) or 3 hours (MAL3) on in vitro ruminal fermentation and CH4 emission. Two different incubation trials were carried out using ruminal fluid from four rumen-fistulated sheep fed a mixed diet 2:1 of lucerne hay and a commercial concentrate. In the first incubation trial the gas production kinetics was assessed over a 144 h period, and in the second trial the main fermentation parameters were determined after 16.5 h incubation. The MAL1 treatment caused minor changes in the chemical composition of both feeds and had no negative effects on gas production parameters compared with the untreated SS and SM, but reduced the estimates of DM effective degradability (DMED) by 20.3 and 3.6% for SS and SM, respectively. Moreover, this treatment was effective in reducing protein degradation, as indicated by the reduced NH3-N concentrations (by 26.5 and 14.5% for SS and SM, respectively) compared with the untreated samples. However, the MAL1 treatment did not increase the concentration of ADIN in SS or SM, indicating that it did not produce protein damage. The protein protection was associated with reductions in CH4 production (15.5 and 11.3% for SS and SM, respectively), the proportion of CH4 in the gas produced, and in the ratios CH4/total VFA and acetate/propionate ratio, thus showing a clear improvement of the efficiency of fermentation. On the contrary, the MAL3 treatment led to an overprotection associated to an important reduction of the nutritive value, as shown by the augmented neural detergent fibre, acid detergent fibre, lignin, NDIN and ADIN contents, as well as the strong reductions in the gas production values, DMED effective degradability and VFA production compared with those in the untreated samples. Experiment 4. The aim of this study was to compare the in vitro fermentation of malic acid-heat (150ºC for 1 h) treated SS and SM with that of the untreated feeds but supplemented with malic acid or disodium malate at 6 and 16.5 h of incubation. Moreover, the influence of the type of inoculum was investigated by using ruminal fluid from four rumen-cannulated sheep and fed a either a 50:50 hay:concentrate diet (MC) or a 15:85 barley straw:concentrate (HC) diet. The diets were representative of those for medium-lactation animals and fattening ruminants under intensive systems of production, respectively. The protective treatment was more effective than that observed in the previous experiment, although the same SS and SM samples were used. The average reductions in CH4 production at 16.5 h incubation were 60.3 and 26.7% for SS and SM, respectively, and in the NH3-N concentrations were 45.3 and 17.2%, respectively. Moreover, a highly significant (P < 0.001) positive relationship was observed between the concentrations of NH3-N and CH4 at both incubation times for both feeds. The treatment also resulted in a reduction of the ratios CH4/total VFA and acetate/propionate. The use of the same dose of malic acid and its disodium salt as additive had some positive influence on fermentation, but the effects were more reduced compared with those of the malic acid-heat treatment. The effects of the malic acid-heat treatment were more pronounced with the HC inoculum than with the MC incoulum for some fermentative parameters.