Marcadores inmunológicos y genéticos asociados a infecciones causadas por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis en ganado bovino

Résumé

La paratuberculosis (PTB) bovina es una enteritis granulomatosa crónica causada por Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (MAP) que afecta a rumiantes tanto domésticos como silvestres. El control de la enfermedad se fundamenta en la aplicación de medidas higiénico-sanitarias en las explotaciones y en el diagnóstico y eliminación de animales infectados. Sin embargo, el diagnóstico de animales infectados con MAP está fuertemente condicionado por la falta de sensibilidad de las técnicas diagnósticas disponibles. Estas limitaciones inciden sobre la necesidad de desarrollar nuevas estrategias de control de la PTB que permitan la detección de animales con infección subclínica o la selección genética de animales naturalmente resistentes a la infección.En la presente Tesis Doctoral hemos identificado mediante análisis transcriptómico (RNA-seq), genes diferencialmente expresados en muestras de sangre periférica (PB) y válvula ileocecal (ICV) de animales con diferentes tipos de lesiones asociadas a la PTB (focales y difusas) respecto a animales control (sin lesiones). El análisis proporcionó información valiosa sobre la respuesta del hospedador a una infección natural con MAP, y permitió identificar genes, procesos biológicos, rutas metabólicas y redes de proteínas, desregulados en animales con lesiones focales y difusas que no habían sido previamente descritos, como la inhibición de la vía de señalización de CXCL8/IL8. El número de genes diferencialmente expresados fue mayor en muestras de ICV que en muestras de PB. Se identificaron cinco genes diferencialmente expresados en muestras de PB e ICV, independientemente del tipo de lesión, incluyendo el CXCL8/IL8, APOLD1, IFI27, KIAA1324L y ARAP2. Así mismo se identificaron 2 rutas metabólicas enriquecidas comunes a PB e ICV de los animales con lesiones difusas: respuesta defensiva (GO:0006952) y respuesta inmune (GO:0006955). El gen más sobre expresado en las muestras de ICV, independientemente del tipo de lesión, fue el precursor de la intelectina 2 (ITLN2), lo que sugería que podría ser utilizado como biomarcador de la infección por MAP en muestras de tejido. Por otro lado, el gen más sobre expresado en muestras de PB de animales con lesiones focales, el transportador ABCA13, fue seleccionado como un posible biomarcador de la infección subclínica. En estudios realizados posteriormente en colaboración con el departamento de Sanidad Animal del SERIDA, se confirmó y validó el potencial de la ITLN2 y del ABCA13 como biomarcadores diagnósticos facilitando ambos la detección de animales con lesiones focales, y difícilmente detectables con los métodos tradicionales de diagnóstico. La integración de datos de expresión génica obtenidos mediante RNA-seq y datos de genotipado de 14 animales infectados con MAP en condiciones naturales, permitió la identificación de 192 y 48 cis-eQTLs reguladores de la expresión de 145 y 43 genes en PB e ICV, respectivamente. Tres de estos cis-eQTLs regulaban la expresión de los genes MECOM (rs43744169), eEF1A2 (rs110345285) y U1 (rs109859270) y fueron asociados con la susceptibilidad a la infección por MAP mediante un estudio de asociación genética dirigida. En dicho estudio, se incluyeron los genotipos para los cis-eQTLs identificados y los datos fenotípicos (histopatología, ELISA, PCR y cultivo bacteriológico) de 986 animales de una población independiente. El genotipo heterocigoto para el rs43744169 (T/C), regulador del gen MECOM, se asoció con una sobreexpresión del gen MECOM, resultados positivos a los test de ELISA, PCR y cultivo bacteriológico, con mayores niveles de MECOM en el plasma de animales infectados con MAP, con una mayor supervivencia intracelular de MAP en ensayos ex vivo llevados a cabo con macrófagos bovinos y con una mayor riesgo de progresión a PTB clínica. Nuestros resultados sugieren que determinadas variantes alélicas del cis-eQTL regulador de la expresión del gen MECOM, un regulador transcripcional de la respuesta inflamatoria mediada por el NF-¿ß, podrían causar una respuesta inflamatoria incontrolada y progresiva que exacerbaría el daño tisular en los animales infectados por MAP. En la presente Tesis Doctoral también se han llevado a cabo tres análisis de asociación a genoma completo utilizando datos de genotipado imputado a secuencia completa y fenotipos antemortem (ELISA, para la detección de anticuerpos frente a MAP) y postmortem (PCR y cultivo de tejidos, para la detección de MAP, y análisis histopatológico de lesiones intestinales). La combinación de varios test diagnósticos mejoró las estimas de heredabilidad respecto al uso de test individuales remarcando la importancia de una correcta definición del fenotipo. En el primer estudio, la combinación de ELISA-PCR-Cultivo (h2= 0,139) permitió identificar 159 SNPs asociados a la susceptibilidad a la infección por MAP. En el segundo estudio se identificaron un total of 192 and 92 SNPs asociados (P < 5 × 10¿7) con la presencia de lesiones multifocales (h2= 0,075) y difusas (h2 = 0,189), respectivamente. Asimismo se identificaron genes candidatos implicados en el proceso de queratinización en los animales con lesiones multifocales, mientras que en los animales con lesiones difusas se identificaron genes candidatos relacionados con el metabolismo del colesterol lo que se confirmó funcionalmente al detectarse niveles más bajos de colesterol en el plasma de animales con lesiones difusas. En el tercer estudio de asociación llevado a cabo, se buscaron variantes asociadas con la tolerancia a la PTB. Se consideró que un animal era tolerante cuando era positivo a PCR y cultivo bacteriológico de tejidos pero no presentaba de lesiones asociadas a la PTB en tejido intestinal. La heredabilidad del fenotipo de tolerancia a la PTB fue alta (h2= 0,55), identificándose 40 SNPs (P < 5×10-7), 9 QTLs y 98 genes candidatos asociados a este fenotipo. El análisis de enriquecimiento funcional utilizando los genes candidatos identificados permitió definir un perfil inmunogenético específico en los animales tolerantes, diseñado para reparar daños en el DNA, controlar la carga bacteriana, modular la inflamación, limitar el daño tisular, y favorecer el establecimiento de una infección persistente,En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral proporcionan información nueva y global acerca de los mecanismos moleculares subyacentes a la susceptibilidad a la infección por MAP y tolerancia a la PTB con aplicaciones en el diagnóstico y control de la enfermedad. El uso de algunos de los biomarcadores identificados mediante RNA-seq ha permitido el desarrollo de nuevas técnicas diagnósticas para la detección de animales subclínicos, difícilmente detectables con los métodos diagnósticos tradicionales. Además, los SNPs identificados podrían ser integrados en los programas de selección de ganado bovino asistidos por marcadores con el objetivo de seleccionar animales menos susceptibles a la infección y más tolerantes a la PTB lo que redundará en una mejor sanidad y bienestar animal, mayor longevidad, reduciría los costes económicos de las explotaciones, minimizaría el uso de agentes antimicrobianos y la aparición de resistencias a los mismos. La consiguiente reducción de MAP ambiental redundaría en un beneficio para la salud pública, especialmente si se confirma una relación causal entre MAP y la enfermedad de Crohn.