Nitric oxide oxidative production from tryptophan derivatives of the indole-3-acetic acid biosynthesis pathway in plants

Resumo

El óxido nítrico (NO) es una pequeña molécula que posee una amplia gama de funciones fisiológicas en los organismos vivos. En las plantas, se ha revelado que el NO está involucrado en muchas funciones fisiológicas, como la germinación, la floración, la senescencia de las hojas y en la respuesta al estrés ambiental. En plantas, la producción de NO ha sido bien caracterizada en rutas reductoras, como la ruta de la nitrato reductasa. Dado que las plantas cultivadas axénicamente con NH4+ como única fuente de N han exhibido contenidos de NO2− y NO3−, esto evidencia la existencia de una vía metabólica para la producción oxidativa de NO. La presencia de óxido nítrico sintasas (NOS) en bacterias, hongos y animales ha dado lugar a una intensa búsqueda de una enzima similar a la NOS en las plantas. Las oximas (R1R2C=NOH) son compuestos importantes que conectan los metabolismos general y especializado que se ha informado que liberan NO en entornos básicos. En particular, la planta oxima indol-3-acetaldoxima (IAOx) está relacionada con la síntesis de glucosinolatos en Brassicaceae y es un intermediario de la biosíntesis dependiente de Trp del ácido in-dol-3-acético (IAA), compartiendo ambos oxima y estructura indólica IAA. Además, se ha descrito bien que el IAA encaja e interactúa en el centro activo de la peroxidasa de rábano picante (POD). De hecho, la reacción de POD con IAA se ha sugerido como una terapia oncológica para producir especies tóxicas. A lo largo del primer capítulo de este trabajo, se probaron varias enzimas y oximas, incluida la IAOx, para determinar la producción de NO. optimizando los requisitos técnicos y las condiciones de reacción para su detección y medición. Como resultado, se demostró la producción de NO in vitro tras la oxidación de IAOx catalizada por POD, así como el importante papel del radical superóxido (O2−) en esta reacción. Además, se demostró que el O2− y las flavinas aumentaron significativamente la producción de NO, mientras que el oxígeno (O2) y el agotamiento de O2− la redujeron. Además, se evaluó que el IAOx actuaba como sustrato de la enzima de ratón iNOS, produciendo cantidades significativas de NO. Finalmente, considerando los resultados obtenidos, se sugirió una nueva hipótesis para la producción oxidativa de NO en plantas, denominada Mecanismo para la Construcción de un Análogo de la Sintasa de Óxido Nítrico (MECANOS). En el segundo capítulo, los efectos de la exposición a IAOx en plantas de tipo salvaje (WT) de Arabidopsis thaliana, así como su acumulación en mutantes sur1.1 se analizaron en plantas que crecieron en NH4+ como única fuente de N. Posteriormente, estas plantas mostraron el típico fenotipo de superraíz, que comparte características con las plantas expuestas al NO y ha sido descrito como consecuencia de la acumulación de AIA; aunque se ha demostrado que el fenotipo IAOx difiere del que se presenta tras la exposición IAA. Además, se informaron niveles más altos de NO en raíces de A. thaliana expuestas a IAOx que en el control o en plantas expuestas a IAA, mediante la sonda de detección DAF-2 DA. Aún más, ambas plantas WT expuestas a mutantes IAOx y sur1.1 mostraron mayores niveles de IAA interno que el control no tratado. Finalmente, el análisis de la expresión genética de varias peroxidasas de A. thaliana mostró que ambas plantas WT expuestas externamente a IAOx y sur1. 1 mutantes regularon a la baja estas enzimas extracelulares o intracelulares, respectivamente, lo que demuestra que la producción de NO por IAOx estaba estrechamente regulada transcripcionalmente. En conjunto, se demostró que los efectos in vivo de IAOx en A. thaliana son consecuencia de una acumulación de IAA y un aumento de NO. En el tercer capítulo, se abordó el análisis de los efectos de IAOx sobre los contenidos moleculares de cultivos celulares de A. thaliana. Con éxito, un total de 26 moléculas fueron detectadas por GC-MS y catalogadas. Posteriormente, un proceso de marcaje previo a un Análisis de Componentes Principales (PCA) confirmó que la reducción en los contenidos de Trp observada en las células estaba relacionada con los tratamientos con IAOx y S-nitrosoglutatión donante de NO (GSNO) y, por tanto, con el NO. Aún más, las diferencias entre los contenidos moleculares de las células tratadas con IAOx y GSNO se explicaron principalmente por las del ácido bencenopropanoico, un miembro de la familia de los fenilpropanoides altamente asociado con los niveles de IAA. En consecuencia, la adición de IAOx de hecho produjo NO dentro de las células de A. thaliana, y IAOx puede servir como fuente de IAA o alterar la homeostasis. Con todo, a lo largo de las páginas de este trabajo, se proporcionan varias pruebas in vitro e in vivo para afirmar que la oxidación de IAOx produce NO, junto con varias pruebas de los efectos del NO en la organogénesis de la raíz, la expresión génica y contenidos moleculares en plantas de A. thaliana. e IAOx pueden servir como fuente de IAA o alterar la homeostasis. Con todo, a lo largo de las páginas de este trabajo, se proporcionan varias pruebas in vitro e in vivo para afirmar que la oxidación de IAOx produce NO, junto con varias pruebas de los efectos del NO en la organogénesis de la raíz, la expresión génica y contenidos moleculares en plantas de A. thaliana. e IAOx pueden servir como fuente de IAA o alterar la homeostasis. Con todo, a lo largo de las páginas de este trabajo, se proporcionan varias pruebas in vitro e in vivo para afirmar que la oxidación de IAOx produce NO, junto con varias pruebas de los efectos del NO en la organogénesis de la raíz, la expresión génica y contenidos moleculares en plantas de A. thaliana.