Efecto de la vacunación sobre la protección y la respuesta inmunitaria frente a la paratuberculosis en modelos experimentales "in vitro" e "in vivo" de pequeños rumiantes

Abstract

La paratuberculosis es una enfermedad crónica de los rumiantes causada por la bacteria intracelular Mycobacterium avium subespecie paratuberculosis (Map). Hasta el momento, la vacunación ha sido considerada el método de control con una mejor relación coste-beneficio, al reducir la aparición de nuevos casos clínicos y la excreción fecal de bacilos. No obstante, su efecto protector es incompleto y aún no se conoce en profundidad cómo influye sobre la patogenia de la enfermedad y la respuesta inmunitaria del hospedador. Además, la vacunación frente a paratuberculosis se ha asociado con un efecto protector inespecífico frente a otras infecciones, relacionadas o no con micobacterias, un fenómeno que podría ser causado por el establecimiento de lo que se conoce como respuesta inmunitaria entrenada. Esta respuesta esta mediada por células de la respuesta inmunitaria innata, como los macrófagos, células dianas de Map, o los neutrófilos. Teniendo en cuenta el número limitado de trabajos destinados a estudiar las características de la respuesta protectora tras la vacunación, el objetivo general de esta Tesis Doctoral consiste en investigar su influencia en la respuesta inmunitaria del hospedador, tratando de esclarecer aquellos factores relacionados con la protección. Para poder realizar posteriormente estudios in vitro sobre el efecto de la vacunación en la actividad de neutrófilos y macrófagos, el primer estudio de esta Tesis consistió en establecer un protocolo estandarizado y efectivo para el aislamiento simultáneo de células mononucleares a partir de sangre periférica (PBMCs) y neutrófilos, así como la purificación de monocitos y la obtención de macrófagos derivados de monocitos (MDMs), a partir de sangre periférica de ovejas y de cabras. Para ello, se compararon distintas técnicas de aislamiento o purificación, así como diversas condiciones de cultivo para la maduración de monocitos. La estimación del rendimiento de cada protocolo, la pureza y las características fenotípicas de las poblaciones celulares obtenidas se determinaron mediante recuento celular en cámara de Neubauer, microscopía y citometría de flujo. La mezcla de las capas de leucocitos y de células rojas durante la separación con Lymphoprep™ permitió aislar un gran número de PBMCs y neutrófilos con una elevada pureza a partir de la misma muestra de sangre. Por otro lado, se observó que las columnas inmunomagnéticas proporcionan un buen rendimiento (nº monocitos/nº inicial de PBMCs) en la obtención de monocitos con una elevada pureza, determinado también mediante el porcentaje de células CD14+ , CMH-II+ y CD11b+ . Estos valores fueron superiores a los encontrados en los monocitos purificados mediante adherencia, debido a la presencia de un mayor número de linfocitos contaminantes empleando esta última técnica que, sin embargo, no interfirió en la maduración de monocitos a macrófagos, ya que el número final de MDMs fue superior en los monocitos aislados mediante adherencia. Posteriormente, la suplementación de los cultivos de monocitos con concentraciones crecientes de GM-CSF incrementó de manera proporcional el número de MDMs en comparación con el suero autólogo. Por lo tanto, siguiendo el protocolo establecido en este estudio es posible realizar el aislamiento simultáneo de PBMCs y neutrófilos con una elevada eficiencia y pureza. Así mismo, estos PBMCs son aptos para la purificación de monocitos y la obtención de MDMs con cualquiera de las técnicas analizadas, según las necesidades del experimento y siguiendo las condiciones de maduración establecidas. En este caso, se eligió la técnica de adherencia para la purificación de monocitos por ser la que proporcionó un mayor número de MDMs. El segundo estudio de la Tesis se centró en estudiar el efecto de la vacuna inactivada Silirum® sobre la respuesta inmunitaria generada en los macrófagos un mes después de la vacunación. Se emplearon CaMØs (MDMs caprinos) procedentes de cabras vacunadas con Silirum® y sin vacunar, e infectadas in vitro con Map, tras lo cual se determinó la viabilidad de Map y su cuantificación mediante cultivo bacteriológico y reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR), respectivamente. Además, también se analizaron los niveles de expresión de distintas citoquinas pro y antiinflamatorias e iNOS mediante PCR con transcripción inversa (RT-qPCR) y se estimó el número de CaMØs infectados, así como el grado de infección, mediante inmunofluorescencia. Estas pruebas reflejaron una reducción significativa de la viabilidad de Map en los sobrenadantes y los CaMØs procedentes de las cabras vacunadas, que se acompañaba de un mayor porcentaje de infección y un mayor número de bacterias internalizadas en los CaMØs de este mismo grupo en comparación con los no vacunados. Además, los CaMØs procedentes de animales vacunados mostraban una mayor expresión de iNOS (acción proinflamatoria) e IL-10 (antiinflamatoria), mientras que solo la expresión MIP-β (proinflamatoria) se encontraba elevada en los animales no vacunados. Estos resultados sugieren que la vacunación frente a paratuberculosis modifica la respuesta de los CaMØs, de forma que aumentan su capacidad fagocítica y antimicrobiana frente a Map, lo que aparece asociado a una mayor producción de citoquinas con acción tanto pro como antiinflamatoria. El tercer estudio de la Tesis tuvo como fin valorar el efecto de la administración de Silirum® sobre la generación de trampas extracelulares de neutrófilos (NETs) en respuesta a la infección in vitro con Map y otros patógenos no relacionados con micobacterias. Para ello, se utilizaron ovejas vacunadas y sin vacunar, a partir de las cuales se aislaron neutrófilos sanguíneos que fueron infectados in vitro con Map, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Se analizó la formación de NETs por medio de la visualización mediante inmunofluorescencia del ADN, la mieloperoxidasa y la elastasa, y se llevó a cabo una cuantificación del ADN extracelular (PicoGreen™) mediante fluorimetría. Estas pruebas demostraron que la infección con Map es capaz de estimular la liberación de NETs, aunque en menor medida que S. aureus y E. coli. No obstante, no se detectaron diferencias entre las ovejas vacunadas y las no vacunadas, independientemente de la infección y del tiempo post-vacunación. Estos resultados sugieren que la liberación de NETs no jugaría un papel importante en la respuesta inmune protectora tras la vacunación frente a paratuberculosis, al menos durante el primer mes post-vacunación. No obstante, es posible que otros mecanismos antimicrobianos desarrollados por estas células y no analizados en este estudio, puedan estar implicados en esta respuesta. El cuarto y último estudio consistió en valorar el efecto que tiene la vacunación homóloga (frente a paratuberculosis) o heteróloga (frente a tuberculosis) sobre la respuesta inmunitaria y la protección en cabritos infectados de forma experimental con Map, y conocer el papel que puede jugar cada uno de los componentes de estas vacunas. Con este fin, se emplearon cabritos de un mes de edad divididos en varios grupos en función de la vacunación (Silirum®, HIMB-vacuna inactivada frente a Mbv o no vacunados), inmunización (bacterias inactivadas o adyuvantes) y/o infección. A los 45 días post-vacunación, los animales fueron infectados oralmente con Map y, posteriormente, sacrificados a los 190 días post-vacunación. Mensualmente, se recogieron muestras de sangre para la determinación de la respuesta inmunitaria periférica y la proporción de subpoblaciones linfocitarias mediante la prueba de liberación de IFN-γ (IGRA) o la detección de anticuerpos (ELISA), y citometría de flujo, respectivamente. Además, tras el sacrificio, se recogieron muestras de heces (cultivo bacteriológico) y de intestino y nódulos linfáticos asociados para la valoración de la producción local de IFN-γ (IGRA), la detección de Map (qPCR y cultivo bacteriológico), el estudio de las subpoblaciones linfocitarias (citometría de flujo) y el examen histológico. En todos los grupos de animales infectados se observaron lesiones granulomatosas, independientemente de la vacunación o la inmunización. Sin embargo, los grupos vacunados con Silirum® (frente a Map) o HIMB (frente a Mbv) mostraron una considerable reducción del número y la gravedad de dichas lesiones, que se acompañaba de una elevada respuesta celular y humoral periféricas. También se observó una disminución del número de granulomas en los animales inmunizados con las cepas vacunales y los adyuvantes en comparación con el grupo no vacunado e infectado. Cabe destacar que esta reducción fue incluso mayor en las cabras a las que se les administró el adyuvante, en comparación con aquellas que fueron inmunizadas con cepas vacunales. Por otro lado, no se observaron diferencias en la proporción periférica o local de las diferentes subpoblaciones de linfocitos, ni en la respuesta inmunitaria local, entre los grupos establecidos. A la luz de estos resultados, tanto la vacunación frente a paratuberculosis como a tuberculosis ofreció una protección homóloga y heteróloga, respectivamente, contra la infección por Map. Además, los animales inmunizados con el adyuvante experimentaron una reducción del número de lesiones, no asociada a la presencia de una respuesta inmunitaria específica frente a Map detectable, que podría estar mediada por un mecanismo de inmunidad inespecífica que necesita ser esclarecido.