Influencia de la penicilina y de las hormonas sexuales 17 beta-estradiol y progesterona sobre la infección por Chlamydia abortus en líneas celulares de endometrio y trofoblasto de origen ovino

Resumen

Chlamydia abortus es un patógeno intracelular obligado que causa abortos al final de la gestación en pequeños rumiantes. En ovejas no gestantes, el microorganismo puede establecer una infección latente o subclínica hasta que se produce la gestación, momento en el cual se reactiva, invade la placenta y produce el aborto. Los mecanismos concretos que desencadenan la reactivación de C. abortus no se conocen en la actualidad. Estudios previos sugieren que las fluctuaciones de las hormonas que regulan los ciclos reproductivos en ovejas, en concreto el estradiol (E2) y la progesterona (P4) pueden estar asociadas con la reactivación de C. abortus. Sin embargo, esta asociación no se ha estudiado hasta ahora. Los objetivos de esta tesis son: (i) evaluar la influencia de la penicilina y del E2 y la P4 en el crecimiento de C. abortus in vitro; (ii) analizar la ultraestructura de inclusiones clamidiales desarrolladas en distintas líneas celulares y expuestas a penicilina, E2 o P4, y (iii) estudiar cambios en la respuesta transcripcional de C. abortus cultivada en distintas líneas celulares y expuesta a penicilina, E2 o P4. Los experimentos se llevaron a cabo sobre dos líneas celulares de origen ovino: la línea AH-1, procedente de trofoblasto y la línea LE, de epitelio endometrial. Los cultivos fueron tratados con penicilina, E2 o P4 antes de ser infectados con C. abortus. Utilizamos técnicas de inmunofluorescencia indirecta para determinar el número, tamaño y forma de las inclusiones intracitoplasmáticas en los distintos cultivos; además, realizamos aislamiento de cuerpos elementales a partir de los sobrenadantes de los cultivos, y finalmente se recogieron las células infectadas de cada cultivo para determinar la cantidad de ADN clamidial por q-PCR. Para evaluar el efecto de la penicilina y las hormonas en la ultraestructura de las inclusiones se recogieron pellets celulares a las 72 horas post-infección (hpi) y se observaron por MET. Los cambios transcripcionales de C. abortus ante los tratamientos fueron estudiados a partir del ARNm de células infectadas y recogidas a las 48 y 72 hpi. Se analizaron 16 genes relacionados con el ciclo de desarrollo clamidial mediante q-PCR. En general, las hormonas sexuales E2 y P4 aumentaron la infectividad de las células AH-1 y LE, mientras que la penicilina produjo el efecto contrario. Los cultivos de C. abortus tratados con penicilina mostraron, por primera vez en esta especie, características típicas del estado de persistencia como la aparición de inclusiones de pequeño tamaño que contenían cuerpos reticulares anormalmente grandes y un perfil de genes caracterizado por una regulación al alza de genes relacionados con la respuesta a estrés y una regulación a la baja de genes relacionados con la síntesis de proteínas de membrana y división celular, en ambas líneas celulares y momentos post-infección estudiados. Los genes omcA y omcB (proteínas de membrana), dnaK (respuesta a estrés) y hctA (conversión de CR a CE) se proponen como indicadores del estado de persistencia in vitro inducido por penicilina en Chlamydia abortus. Por otra parte, la suplementación del medio con hormonas produjo diferentes resultados en función de la línea celular utilizada, lo que sugiere que los efectos de las hormonas en el desarrollo del ciclo clamidial se producen de forma indirecta, a través de alteraciones en el ambiente de la célula hospedadora. Además, la progesterona y, en menor medida el 17?-estradiol, indujeron la aparición de formas aberrantes en cultivos de células LE, aunque este hecho no se asoció con alteraciones en los genes estudiados en Chlamydia abortus. Por tanto, no su pudo establecer un patrón común de expresión de genes que sea válido para distintos sistemas de inducción de persistencia clamidial.