La simulación del ambiente oviductal modula la capacitación espermática y la fertilidad in vitro en la especie porcina

Laburpena

La fecundación es un proceso biológico complejo en el que innumerables factores están directa o indirectamente implicados. Aunque la eficiencia de la fecundación in vitro (IVF) es, en animales sanos, menor que in vivo, en algunas especies de mamíferos como la bovina o la murina se ha alcanzado un alto rendimiento, sin embargo en la especie porcina el rendimiento de la IVF es aún subóptimo. Actualmente, la penetración polispérmica de los ovocitos permanece como uno de los principales obstáculos en la IVF porcina y la simulación de las condiciones in vivo de capacitación espermática y fecundación se postula como la mejor estrategia para mejorar los resultados de IVF. La concentración de bicarbonato (HCO3-), uno de los efectores de la capacitación espermática a través de la activación de la vía de la adenilato ciclasa soluble (sAC)/AMP cíclico (cAMP)/proteína kinasa A (PKA), varía enormemente en los diferentes ambientes que los espermatozoides maduros atraviesan desde la cola del epidídimo (~3-4 mM) al oviducto (de 10 mM en el istmo hasta entre 25 y 90 mM en el lugar de fecundación, dependiendo de la fase del ciclo estral). En el oviducto, la baja concentración de HCO3- en la porción caudal del istmo permite a los espermatozoides permanecer unidos a las células del epitelio oviductal en un estado quiescente y formando el reservorio espermático (SR). Durante la ovulación, acontece un incremento de la concentración de HCO3- que desencadena la hiperactivación del espermatozoide y permite su liberación desde el SR. La secreción de HCO3- provoca un gran incremento del pH en la fase periovulatoria desde aproximadamente 6,5 en el istmo a incluso 8,0 en la ampolla oviductal. El flujo creciente de HCO3- y pH permite el transporte del espermatozoide al lugar de fecundación en la unión ampular-ístmica (AIJ), el desarrollo de la reacción acrosómica (AR) para atravesar las envolturas del ovocito y la penetración. El ambiente oviductal periovulatorio en el que estos fenómenos tienen lugar es bastante diferente de las características in vitro de los medios habitualmente utilizados para la capacitación espermática y IVF, que contienen una concentración de HCO3- estándar de 25 mM y un pH de 7,4. Estos procesos biológicos in vivo tienen lugar en fluidos específicos del tracto genital de la hembra, los fluidos uterino (UF) y oviductal (OF). Sin embargo, la capacitación in vitro y la IVF se producen actualmente en sistemas estáticos en medios químicamente definidos, con diversos grados de complejidad pero con composición y características físicas limitadas (probablemente distantes de las que se encuentran en las secreciones reproductivas), y en tubos o placas de plástico en las que los gametos contactan aleatoriamente, más que por selección y/o competición espermática. Y ninguno de ellos ha sido extendido ampliamente en los laboratorios de reproducción ni han conseguido eliminar el problema de la polispermia. Este trabajo se centra en el efecto que sobre el rendimiento de la IVF tienen factores como la concentración de HCO3- y el pH del medio (pH extracelular, pHe), las secreciones oviductales periovulatorias y un dispositivo en el que los gametos se disponen físicamente separados y los espermatozoides han de nadar para contactar con los ovocitos. En el Capítulo 1, se estudió el efecto de diferentes concentraciones de HCO3- (0, 5, 15 and 25 mM) en la capacitación de espermatozoides maduros y se evaluaron diferentes parámetros de funcionalidad espermática, incluida la fertilidad in vitro. El pHi se incrementó tras la absorción de HCO3-, pero solo concentraciones extracelulares de 15 mM o superiores activaron la cascada de capacitación de cAMP/PKA en el espermatozoide. El tiempo requerido para producir una alta fosforilación de los sustratos de PKA (PKAs-P) fue dependiente de la concentración de HCO3-, dado que con 15 mM fue más tardía que con la concentración habitual de 25 mM. 15 mM de HCO3- también estimuló una motilidad lineal en los espermatozoides y la fosforilación de tirosina (Tyr-P). Para evaluar la capacidad fecundante de los espermatozoides dependiendo de la concentración de HCO3- del medio, se analizaron dos sistemas: i) un sistema de IVF en una fase (IVF monofásica) en la que los espermatozoides se inseminaron directamente sin ningún tratamiento previo y co-cultivados con los ovocitos en un medio de IVF con las diferentes concentraciones de HCO3-, y ii) un sistema de IVF en dos fases (IVF bifásica) en la que los espermatozoides primero se incubaron durante 60 min en un medio capacitante con diferentes concentraciones de HCO3- y después inseminados en un medio de IVF con los ovocitos y la misma concentración de HCO3- que en la preincubación o superior. Los resultados de la IVF monofásica mostraron que 15 mM produjo una eficiencia más alta (26,2%). En la IVF bifásica, la preincubación y IVF a 15 mM alcanzó un 33,9% de zigotos viables (ovocitos penetrados por solo un espermatozoide), lo que resultó en un incremento significativo del 25,3%. El Capítulo 2 combinó un medio con el pH del oviducto durante la fase periovulatoria (pHe 8,0), una mezcla de componentes oviductales periovulatorios formada por secreciones de los COCs, FF y FO periovulatorio (OFCM) y un dispositivo que interpone una barrera física entre los gametos (un tapón de rosca de tubo Falcon¿ invertido, S) en el que los espermatozoides han de nadar al encuentro con los ovocitos. Los resultados mostraron que el uso combinado de los tres factores estudiados (pHe 8,0, adición de OFCM y el dispositivo S) redujo la polispermia e incrementó la eficiencia final de obtención de zigotos viables a un 48,7% comparado con el sistema clásico a pHe 7,4, carente de OFCM y con el dispositivo W (18,9%). El estudio de la funcionalidad espermática en las condiciones de IVF descritas mostró que tanto pHe como OFCM modulan la capacitación espermática. Los parámetros de motilidad y el estatus de capacitación a través de Tyr-P fue menor a pHe 8,0 y con OFCM. PKAs-P y AR fueron menores en presencia de OFCM, independientemente del pHe. Pudimos concluir que la mayor eficiencia en la IVF con pHe 8,0, presencia de OFCM y el dispositivo S podría ser una consecuencia directa de la acción de los componentes de OFCM sobre los gametos. Los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que las actuales condiciones subóptimas de la IVF en la especie porcina pueden ser mejoradas simulando el ambiente oviductal periovulatorio in vivo. Ajustando la concentración de HCO3- y el equilibrio ácido-base de los sistemas de IVF porcina, añadiendo fluidos oviductales periovulatorios y utilizando un dispositivo en el que los gametos son ubicados físicamente separados pero con posibilidad de contactar, incrementa la eficiencia de la IVF, reduce la polispermia y se obtiene una alta proporción de zigotos potencialmente viables. A pesar de los innumerables factores, conocidos y no conocidos, que influyen en los procesos de capacitación y fecundación, con este trabajo se muestran nuevas vías hacia la mejora de la IVF en la especie porcina y, probablemente, un nuevo modelo de ART para todas las especies.