Transformación genética en trigo común (Triticum aestivum L.) y triticale (xTriticosecale Wittmack) mediante biolística y Agrobacterium tumefaciens

Resumen

El desarrollo de un protocolo de transformación para especies recalcitrantes como el trigo (Triticum aestivium L.) y el triticale (x Triticosecale Wittmack) requiere la identificación y optimización de los factores que afectan a la liberación del ADN dentro de la célula. En este trabajo se han analizados algunos parámetros implicados en la eficacia de la transformación mediante biolística y Agrobacterium tumefaciens de embriones haploides y cigóticos inmaduros de las líneas de triticale 'ATOPE-6' y 'ATOPE-22' y en embriones cigóticos de variedades comerciales de trigo blanco 'Anza' y 'Crakim'. En el caso del bombardeo de partículas las mejores condiciones conseguidas han sido de 6 cm de traltura y 1100 psi de presión de disparo con 24 horas de precultivo de los embriones lo que ha permitido no sólo una alta expresión transitoria del gen uidA, sino además la regeneración de plantas, indicando así que las células no habían sido dañadas en exceso tras el bombardeo. De todos los ensayos se ha logrado obtener una planta transgénica de la variedad de trigo 'Anza' a partir de embriones cigóticos inmaduros transformada con los vectores pAHDx5-BAR y pAHDy10-BAR portadores de los genes de gluteninas HMW 8GludD1-Dx5 t Glud1-Dy10 respectivamente. Además, como gen de selección de las plantas transformadas, los vectores incluyen el gen bar que confiere resistencia al herbicida BASTA. En los estudios de transformación mediante Agrobacterium, se ha analizado el tiempo de precultivo de los embriones previo a la transformación y el tiempo de inoculación con la bacteria. Los análisis de varianza indicaron que hay diferencias significativas entre los distintos tiempos de precultivo y los niveles de expresión del gen uidA en embriones inmaduros pero no hubo diferencias en los tiempos de inoculación, aunque se observó un aumento de la expresión transitoria GUS cuando el tiempo de inoculación se aumentaba. Las condiciones que produjeron un mayor número de foci por embrión inmaduro dureron 0,5 horas en el tiempo de precltivo de los embriones y de 2-3 horas en el tiempo de inoculación con Agrobacterium. En este caso la transformación se llevó a cabo con el sistema binaria pAL154/156 portador de los genes uidA y el gen bar. Finalmente, empleando estas condciones ha sido posible la obtención de una planta transgénica de la variedad 'Craklin' donde además se detectó la transmisión del transgén a su descendencia.