Estrategias moleculares para la identificación de genes implicados en el control de caracteres agronómicos en garbanzo (cicer arietinum l.)

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis El garbanzo (Cicer arietinum L.) es la segunda leguminosa de grano más cultivada en el mundo. España es el principal productor de Europa, siendo Andalucía con 28.322 ha la comunidad autónoma que más superficie le dedica a este cultivo. Esta tesis está centrada en dos caracteres importantes en este cultivo: la resistencia a fusarium y el carácter simple/doble vaina. Fusarium, enfermedad causada por el hongo del suelo Fusarium oxysporum Schlechtend: Fr. f. sp. ciceris, es una de las principales limitaciones de este cultivo causando grandes pérdidas en su producción. La presencia de dos vainas por nudo (o doble vaina) es una mutación espontánea que tiene gran interés desde el punto de vista agronómico ya que los genotipos con doble vaina pueden aumentar la producción e influyen positivamente en su estabilidad. Aunque gran parte de la mejora del garbanzo se ha realizado empleando metodologías tradicionales, actualmente gracias al desarrollo de la genómica se están incluyendo nuevas herramientas que permiten ayudar a aumentar su eficacia (Jain et al 2013, Varshney et al 2013: Gupta et al 2017). Por todo lo expuesto anteriormente el objetivo general de esta tesis ha sido aplicar distintas herramientas genómicas para identificar genes candidatos asociados a la resistencia a fusarium y al carácter simple/doble vaina. Los objetivos específicos han sido: 1- Uso de marcadores moleculares para comprobar la naturaleza híbrida de cruzamientos para obtener material de interés en el programa de mejora de garbanzo 2- Identificación de genes potencialmente implicados en la resistencia a fusarium mediante saturación con marcadores moleculares, físicamente posicionados en la región de interés, y su confirmación mediante estudios de expresión. Estos trabajos están centrados en la raza 5 de fusarium (Foc5) por ser la más importante en la Cuenca Mediterránea. 3- Identificación, caracterización y validación del gen responsable del carácter simple/doble vaina utilizando aproximaciones genéticas, moleculares y bioinformáticas. 2.Contenido de la investigación Esta tesis está estructurada en cuatro capítulos. En el capítulo I, se muestra un estudio de programas de cruzamientos y el uso de marcadores moleculares STMS (Sequence Tagged Microsatellite Site) para evaluar la naturaleza híbrida de las F1 obtenidas. Estos marcadores han resultado ser una valiosa herramienta para la detección de híbridos, ya que son fáciles de visualizar y tienen un bajo coste. Los resultados han quedado reflejados en el artículo Caballo et al (2018). El capítulo II está centrado en el análisis de la región genómica asociada con la resistencia a Foc5 siendo posible delimitar a 820 kb el área relacionada con su resistencia en el cromosoma 2 de garbanzo. Para ello, se han utilizado marcadores STMS, marcadores específicos de genes y SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), ubicados en la región interés, analizados en RILs (líneas recombinantes) y NILs (líneas casi isogénicas). En esta región del genoma hay 26 genes, entre ellos una proteína quinasa (LOC101511605) que podría considerarse un gen candidato por su posible implicación en reacciones de resistencia. En el mismo estudio, se analizó una colección de 32 genotipos que diferían en su reacción a Foc5 utilizando marcadores SNPs. El análisis de estos marcadores con métodos de agrupamiento mostró cuatro grupos principales de genotipos, tres de ellos agruparon los genotipos resistentes y el cuarto los genotipos susceptibles. Seis de los SNPs utilizados en este estudio mostraron el mismo patrón entre las líneas resistentes y diferente de las susceptibles, siendo interesantes para su uso en selección asistida por marcadores. Estos resultados han quedado reflejados en la publicación Caballo et al (2019). Continuando con esta línea de trabajo, se realizó un estudio de expresión (Capítulo III de esta tesis) con PCR cuantitativa en tiempo real de los genes que se encontraban físicamente posicionados en la región de interés y que por su descripción podrían estar implicados en reacciones de resistencia. Para ello se utilizó una pareja de NILs que difiere en su reacción a Foc5. Los resultados mostraron que la NIL resistente indujo un grupo de genes a las 24 horas después de la inoculación, mientras que la NIL susceptible indujo un segundo grupo de genes, diferentes a los inducidos por la línea resistente, a las 48 horas. En el capítulo IV, se estudia el carácter simple/doble vaina identificándose una deleción de 44 kb en el genotipo JG62 (doble vaina) que incluye el gen CaRAX2-like, entre otros. Utilizando líneas doble vaina procedentes del banco de germoplasma del USDA, se ha encontrado un nuevo alelo en el mismo locus CaRAX2-like, que consiste en mutaciones puntuales en las posiciones 306-307 originando un cambio en dos aminoácidos situados en una región altamente conservada de la proteína silvestre. La caracterización funcional mediante microscopía SEM e hibridación in situ además de estudios de complementación entre genotipos doble vaina con diferentes alelos, nos ha permitido determinar que CaRAX2 es el gen candidato del carácter simple/doble vaina en garbanzo. La información generada en esta tesis es de gran importancia para avanzar en los programas de mejora de este cultivo 3.Conclusión 1. Los marcadores microsatélites han sido útiles para comprobar la naturaleza híbrida de plantas F1 en garbanzo. El uso de marcadores moleculares en los primeros estadios de los programas de mejora implica un ahorro de tiempo, espacio y dinero. 2. Se ha acotado a 820 kb la región del cromosoma 2 de garbanzo relacionada con la resistencia a fusarium raza 5 (Foc5) utilizando marcadores microsatélites, marcadores específicos de genes y SNPs analizados en diferentes materiales vegetales. El uso de parejas de NILs y la detección de recombinantes en poblaciones RILs ha sido clave para delimitar la zona de interés. 3. El análisis con marcadores SNPs asociados a Foc5 en una colección que difiere para su respuesta a la resistencia, ha permitido identificar 6 SNPs coincidentes en líneas resistentes y diferentes a las susceptibles. Estos SNPs podrían ser útiles para utilizarlos en selección asistida por marcadores y mejorar la eficacia de los programas de mejora de garbanzo. 4. El estudio de expresión para Foc5, llevado a cabo en una pareja de NILs, sugiere que la resistencia/susceptibilidad depende del tipo de genes regulados y del tiempo de regulación tras la infección. 5. El análisis de las inflorescencias de NILs simple/doble vaina mediante SEM concluyó que los meristemos I2 de las inflorescencias de las plantas doble vaina generaron de manera secuencial dos meristemos florales. 6. Aplicando diferentes técnicas tanto de mejora clásica como biotecnológicas se ha demostrado que CaRAX2 corresponde al gen SFL responsable del carácter simple/doble vaina en garbanzo. Este gen podría utilizarse en estudios futuros sobre el control del número de flores en leguminosas. 4. bibliografía Caballo C, Castro P, Gil J, Izquierdo I, Millán T, Rubio J (2018) STMS (sequence tagged microsatellite site) molecular markers as a valuable tool to confirm controlled crosses in chickpea (Cicer arietinum L.) breeding programs. Euphytica DOI 10.1007/s10681-018-2314-0 Caballo C, Madrid E, Gil J, et al (2019) Saturation of genomic region implicated in resistance to Fusarium oxysporum f. sp. ciceris race 5 in chickpea. Mol Breeding 39:16. doi: 10.1007/s11032-019-0932-4 Gupta S, Nawaz K, Parween S, et al (2017) Draft genome sequence of Cicer reticulatum L., the wild progenitor of chickpea provides a resource for agronomic trait improvement. DNA Res 24:1–10. doi: 10.1093/dnares/dsw042 Jain M, Misra G, Patel RK, et al (2013) A draft genome sequence of the pulse crop chickpea (Cicer arietinum L.). Plant J 74:715–729. doi: 10.1111/tpj.12173 Varshney RK, Song C, Saxena RK, et al (2013) Draft genome sequence of chickpea (Cicer arietinum) provides a resource for trait improvement. Nat Biotechnol 31:240–246. doi: 10.1038/nbt.2491