Inmovilización de proteinas en matrices solgel caracterización biofísica y aplicación en el desarrollo

Resumen

Habitualmente la inmovilización de proteínas en matrices sol-gel se ha usado como herramienta en biotecnología, principalmente para el diseño y desarrollo de biosensores, estudiando, para ello, la actividad enzimática de las proteínas inmovilizadas, y su variación con el tiempo. Sin embargo, se sabe muy poco sobre como afecta el proceso de inmovilización en matrices sol-gel a las proteínas. Por ello, la presente Tesis tiene dos objetivos: la inmovilización y caracterización de proteínas en matrices sol-gel y su utilización para el desarrollo de biosensores fluorescentes. Esta Tesis se organiza en dos grandes bloques independientes, en el primero de ellos se describe la puesta a punto de un sistema de inmovilización de proteínas en matrices sol-gel y la caracterización de dos enzimas, la lisozima y la superóxido dismutasa, que han sido inmovilizados según esta metodología. La primera de ellas se seleccionó por ser una proteína muy estudiada, cuya estructura y propiedades en disolución se conocen perfectamente. Y la segunda debido a sus propiedades catalíticas, las cuales sirvieron en el diseño y desarrollo de uno de los biosensores. Con este trabajo se pretendía encontrar pautas de comportamiento comunes en las dos especies inmovilizadas que aportan luz sobre como se encuentran las proteínas en el interior de los poros de sol-gel. La metodología utilizada en este estudio ha sido fundamentalmente la espectroscopia de fluorescencia en estado estacionario y con resolución temporal. Para ello se aprovechó la fluorescencia intrínseca de las proteínas: triptófano en el caso de la lisozima y tirosina en el caso de SOD. La utilización de la fluorescencia en este estudio es posible gracias a la transparencia de las matrices sol-gel que permite el uso de técnicas ópticas. En el caso de la lisozima, al ser una proteína cuya desnaturalización está bajo control termodinámico, también se realizó un análisis detallado de su estabilidad, ut