Empleo de herramientas genómicos para la búsqueda de genes candidatos relacionados con la resistencia a ascochyta fabae y orobanche crenata en habas (vicia faba l.)

Abstract

1. introducción o motivación de la tesis El principal objetivo de los mejoradores modernos es estabilizar el rendimiento mediante el desarrollo de cultivos adaptados y resistentes a estreses bióticos y abióticos. La selección asistida por marcadores (“Markers assisted selection”, MAS) es una alternativa a los problemas que se plantean en la mejora clásica como los derivados del efecto ambiental, dominancia o interacciones de tipo epistático. La MAS se basa en la identificación de marcadores estrechamente ligados a los genes o regiones genómicas (QTLs) que controlan caracteres de interés y nos permite la selección eficiente de las plantas portadoras del alelo más favorable. En habas, uno de los factores más limitantes de su producción es la susceptibilidad a patógenos como la planta parasita Orobanche crenata y el hongo patógeno Ascochyta fabae. El desarrollo de variedades resistentes a ambos, es una tarea complicada debido a la naturaleza cuantitativa de la resistencia, controlada por numerosos genes sujetos a la influencia del ambiente. Además, el genotipado de marcadores moleculares y la saturación de sus mapas está dificultado por el gran tamaño de su genoma (~ 13.000 Mb). Todos estos factores han limitado la disponibilidad de herramientas genómicas y la información asociada en este cultivo. El objetivo de este trabajo ha sido desarrollar y explotar nuevas herramientas genómicas en habas para desvelar a nivel molecular posibles mecanismos de defensa frente al hongo patógeno Ascochyta fabae y la planta parásita Orobanche crenata, causantes de grandes pérdidas en su producción. Se ha pretendido ampliar la información genética sobre dichos mecanismos de resistencia e identificar posibles genes candidatos donde poder desarrollar marcadores diagnóstico que permitan extrapolar los resultados de QTL estables entre poblaciones y facilitar la selección precoz de materiales en sus programas de mejora. 2. contenido de la investigación Para conseguir estos fines, se han empleado distintas herramientas genómicas (estructural, comparada y funcional). Así, en el capítulo II, se han utilizado la genómica estructural y la macrosintenia existente entre leguminosas, para saturar dos de los mapas genéticos disponibles por el grupo con marcadores relacionados con la resistencia a ambos patógenos, descritos en otras leguminosas. Dicha saturación, ha permitido refinar la posición de los QTLs existentes e identificar marcadores estrechamente ligados que podrían facilitar el proceso de selección. Además, el genotipado de estos nuevos marcadores ha ayudado al desarrollo de un mapa consenso para este cultivo. En el capítulo III, utilizando herramientas de genómica funcional, se ha tratado de profundizar en las rutas implicadas en la interacción planta-patógeno e identificar potenciales genes de resistencia que pudieran ser últiles en la mejora asistida por marcadores. Para ello se ha caracterizado el transcriptoma de dos líneas parentales (29H y Vf136) sometidas a la infección por A. fabae y obtenido sus perfiles de expresión génica. Aparte de proporcionar nueva información genómica, el estudio han revelado una amplia variedad de posibles mecanismos y rutas implicadas. El gran número SNPs e InDels identificados en los transcriptos ofrece, además, una posibilidad rentable de saturar los mapas disponibles y de identificar genes responsables de la resistencia. Para finalizar, en el capítulo IV, se ha genotipado un conjunto de SNPs expresados diferencialmente entre ambos parentales, relacionados con mecanismos de resistencia. Ello ha permitido situar nuevos marcadores más robustos y transferibles (SNPs y ESTs) dentro de los intervalos de confianza de los QTLs de resistencia ya descritos, facilitando su comparación con otras poblaciones de habas y con otras leguminosas 3.conclusión La transferencia de información entre leguminosas (sintenia) nos ha ayudado a saturar y actualizar la posición de QTLs previamente identificados relacionados con la resistencia a ambos patógenos. Los nuevos marcadores introducidos se han desarrollado en secuencias codificantes, por lo que son marcadores mucho más estables y transferibles entre laboratorios que los marcadores RAPD mayoritarios en los mapas previos y que han limitado su comparación con otras leguminosas. Se han aplicado herramientas de genómica funcional (Capitulo III) para caracterizar un transcriptoma de habas en respuesta a la infección por A. fabae. El gran número de transcriptos (39.185) obtenidos, está ayudando a identificar genes asociados con la resistencia a este patógeno. La comparación de estos transcriptos con genomas mejor caracterizados (A. thaliana, M. truncatula y C. arietinum) nos ha permitido profundizar en la interacción planta-patógeno, así como identificar marcadores moleculares relevantes que podrán ayudar al futuro desarrollo de marcadores útiles en MAS. El análisis de expresión diferencial entre genotipos resistentes y susceptibles identificó diferencias significativas en 850 transcriptos. Entre ellos proteínas PR relacionadas con la activación de mecanismos de defensa, un factor de transcripción relacionado con MYB, varias enzimas y proteínas implicadas en la síntesis de fitohormonas, fitoalexinas y una proteína de unión al elicitor de quitina (CEBiP) necesaria para el reconocimiento de quitina. También se identificaron transcritos que intervienen en la formación de la pared celular (sintasa de celulosa), flavonoides (dihidroflavonol reductasa) y enzimas implicadas en la biosíntesis de metabolitos secundarios; además de un transcripto que codifica MLO, un gen que confiere resistencia al oídio en monocotiledóneas y dicotiledóneas. Todos estos datos han proporcionado una información muy valiosa sobre posibles genes candidatos y vías involucradas en los mecanismos de resistencia a A. fabae. Finalmente el genotipado de SNPs expresados diferencialmente ha permitido saturar el mapa disponible y refinar la posición de QTLs detectados en estudios previos. 4. bibliografía