Innate immunity against small ruminant lentiviruses (SRLV)characterization of APOBEC3-derived restriction

Zusammenfassung

La infección por lentivirus de pequeños rumiantes (SRLV) está extendida en todo el mundo afectando la productividad de la ganadería ovi-caprina. La ausencia de tratamientos y de estrategias de vacunación aplicables en campo limita su control a la identificación de los animales infectados con métodos serológicos que, sin embargo, no detectan todos los animales infectados impidiendo la erradicación y favoreciendo la re-emergencia. Se han empleado diferentes estrategias de inmunización incluyendo virus inactivado, vivo modificado genéticamente para su atenuación, proteínas recombinantes o vacunas ADN que, sin embargo, no inducen inmunidad esterilizante. Las vacunas inactivadas dan lugar a un exacerbamiento de la enfermedad tras el desafío experimental, posiblemente debido a procesos mediados por el sistema inmune. La administración de vacunas ADN incluyendo moléculas coestimuladoras B7 o virus atenuados de manera natural (genotipo E) son las opciones más prometedoras hasta el momento desde el punto de vista de la protección. Sin embargo, la aplicación de vacunas ADN a través de partículas de oro coloidal no parece aplicable en campo al ganado ovino y los virus atenuados suponen una infección de facto que podría originar problemas de recombinación con las estirpes de SRLV que circulen en el territorio. Los factores de restricción inducibles por interferón son proteínas con capacidad para inhibir distintas fases del ciclo de replicación de los lentivirus. Algunas especies moleculares de TRIM5α ovino como algunas proteínas APOBEC3 (Z2Z3) poseen actividad antiviral no sólo frente a los SRLV sino también frente a lentivirus que infectan otras especies como la humana. La caracterización de factores del hospedador que sean capaces de restringir la replicación de los lentivirus podría abrir una nueva estrategia de controlar las infecciones basada en la terapia o en la selección genética En esta tesis se llevaron a cabo los siguientes estudios: a) Identificación y caracterización de la restricción por APOBEC3 ovino frente a los SRLV. Se estudiaron dos tipos celulares que muestran restricción natural frente a los SRLV, monocitos y macrófagos M1, identificando la isoforma Z1 entre las proteínas APOBEC3 ovinas. En la caracterización genética de A3Z1 se identificó una isoforma adicional resultante de splicing alternativo, también presente en el transcriptoma humano y que carece del dominio citidín deaminasa (A3Z1Tr) característico de este tipo de proteínas. La expresión de estas proteínas se induce tanto tras la incubación con IFN-g como con la infección viral. Ambas son resistentes a la degradación por Vif de SRLV y pueden encapsidarse en los viriones. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se pudo determinar que ambas proteínas pueden interactuar, así como con Vif viral, a pesar de la resistencia que presentan a su degradación. La expresión endógena de A3Z1 en células en cultivo tipo fibroblasto (TIGEF) tan solo fue posible empleando estrategias de expresión transitoria ya que los intentos de expresión permanente resultaron en cultivos abortivos. Las células TIGEF que expresan A3Z1 muestran una menor producción de SRLV. Ensayos de infectividad de un solo ciclo (single cycle infection) con vectores virales basados en HIV-1, MLV y SIV indican que A3Z1 ovino es capaz de inhibir la infectividad de dichos vectores. El mecanismo de restricción parece ser la actividad citidín deaminasa en el contexto GA/AA. En ambos casos, la co-expresión de la isoforma truncada mitiga la restricción probablemente por competición estérica con la proteína nativa en el interior de los viriones. b) Caracterización de las vías de degradación de APOBEC3. Se investigó la capacidad de A3Z1 de restringir la infección con estirpes de SRLV que codifican la proteína Vif. Mediante ensayos de inmunoprecipitación se pudo comprobar que CYPA y no CBF-b es el cofactor necesario para la degradación de las proteínas APOBEC3 ovinas, requisito esencial en el caso de A3Z1 y A3Z1Tr. Concentraciones altas de CYPA permiten la degradación de A3Z1 por parte de Vif en diferentes tipos celulares promoviendo así la infección por lentivirus. Sin embargo, no se alcanzan los niveles basales empleando inhibidores del proteasoma y la degradación se produce también en presencia de Vif mutado, incapaz de reclutar el complejo ubiquitín ligasa y por lo tanto degradar proteínas por la vía proteasomal, abriendo la posibilidad a la existencia de vías alternativas que permitan degradar A3Z1. Tan solo la combinación de inhibidores del proteasoma junto con inhibidores de la autofagia consiguieron restablecer los niveles basales de A3Z1 sugiriendo la implicación de ambas vías. Además, la inhibición de la autofagia parece perjudicar la infección por SRLV, sugiriendo que la inducción podría favorecerla. c) Estimulación de la respuesta innata ovina a través de la infección con vectores virales basados en el virus murino Sendai. La infección de células ovinas con un vector viral basado en el virus Sendai que codifica la proteína verde fluorescente (SeV-GFP) resultó ser del 100% incluso en macrófagos de distintos orígenes. La infección con SeV-GFP induce una programación diferente dependiendo del tipo celular ovino, siendo la inducción de A3Z1 en células mieloides de especial importancia. La infección con SRLV y la producción de virus se encontró disminuida en estas células tras el tratamiento con el vector viral. Los sobrenadantes procedentes de estos cultivos fueron capaces de transmitir la restricción a células frescas probablemente debido a la producción de interferón de tipo 1 sugiriendo que podría ser de utilidad en futuras estrategias de inmunización. La restricción también se observó frente a vectores basados en lentivirus. Además, se demostró que la infección con SeV-GFP no se transmite en células ovinas y el vector es no replicativo.