Estudios sobre salmonelosis porcinadiagnóstico microbiológico, papel de los animales silvestres y control mediante estrategias de alimentación

Resumen

La salmonelosis no tifoidea es una de las enfermedades más comunes de las transmitidas al hombre por los alimentos. Principalmente asociada con el consumo de huevos y carne de pollo, en los últimos años están aumentando los casos relacionados con el consumo de carne de cerdo. Un estudio reciente llega incluso a estimar que el cerdo podría ser la primera causa de salmonelosis humana (alrededor de un 56,8% de los casos). La preocupación por proteger la salud humana frente a zoonosis transmitidas por los alimentos ha derivado en la aprobación de numerosas regulaciones y directivas por parte de la Unión Europea (UE) conducentes a establecer mecanismos de control frente a determinadas zoonosis tanto en animales como en productos de origen animal. En concreto, el Reglamento CE nº 2160/2003 establece la obligación de poner en marcha programas específicos para la detección y control de Salmonella a través del control exhaustivo de todas las etapas de la cadena alimentaria ("de la granja a la mesa"), y considera un objetivo principal la reducción de la prevalencia de serotipos de Salmonella con importancia para la salud pública en las granjas de cerdos. Este trabajo de Tesis Doctoral se realiza en este contexto. Para la adecuada puesta en marcha de este tipo de programas de detección y control es necesario conocer aspectos clave del diagnóstico y de la epidemiología de esta infección. Sin embargo, a pesar del gran número de estudios realizados, todavía existen importantes lagunas sobre alguno de ellos. Así, iniciamos esta Tesis Doctoral con un estudio que aborda, mediante aproximaciones estadísticas bayesianas, la evaluación de la sensibilidad diagnóstica de la norma ISO 6579:2002/Amd 1:2007 (Publicación 1 Sensitivity of the ISO 6579:2002/Amd 1:2007 standard method for detection of Salmonella spp. on mesenteric lymph nodes from slaughter pigs). La norma ISO 6579:2002/Amd 1:2007 fue la técnica microbiológica recomendada por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA, según sus siglas en inglés) como método estandarizado de aislamiento de Salmonella spp. a partir de nódulos linfáticos mesentéricos (NLM), para la realización del estudio de referencia sobre prevalencia de Salmonella en cerdos de engorde realizado en 2007 en los Estados miembros de la UE. A pesar de que la especificidad de este método se considera del 100% no existen, sin embargo, estudios sobre su sensibilidad cuando se emplea en NLM. Para estimarla, y ante la ausencia de una población “gold standard”, se recurrió a una novedosa metodología bayesiana basada en el uso de dos técnicas diagnósticas distintas aplicadas a individuos de dos poblaciones diferentes con prevalencias también distintas. Como segundo método diagnóstico se eligió una PCR que amplificaba un fragmento del gen invA. Los resultados mostraron una sensibilidad del método ISO 6579:2002/Amd 1:2007 de alrededor del 87,6%, un resultado generalmente más alto que el obtenido en otros estudios que empleaban distintas matrices y protocolos de cultivo. Además se comprobó que la técnica de PCR puede ser útil como método complementario al cultivo bacteriológico en los programas de vigilancia y control de la salmonelosis porcina. Los siguientes tres estudios de esta Tesis Doctoral tuvieron como finalidad obtener un mayor conocimiento de la epidemiología de la salmonelosis porcina, evaluando, en particular, el papel que los animales silvestres podrían jugar en la infección de los cerdos destinados a consumo humano. Con la Publicación 2 (Epidemiology of subclinical salmonellosis in wild birds from an area of high prevalence of pig salmonellosis: phenotypic and genetic profiles of Salmonella isolates) se investigó la epidemiología de la salmonelosis subclínica en aves silvestres (prevalencia, serotipos aislados, factores asociados, perfiles de resistencia antibiótica) y su posible relación con la cercanía de estas aves a las explotaciones porcinas. Para ello se recogieron muestras de heces de aves silvestres capturadas tanto en las inmediaciones de cebaderos porcinos como en zonas naturales (bosques, riberas de ríos, etc.) en las que no había granjas porcinas en un radio de 2 Km. Todos los aislados obtenidos fueron caracterizados de acuerdo con el serotipo y perfil de resistencia a antibióticos. Además, las cepas del serotipo Typhimurium fueron fagotipadas y analizadas mediante la técnica de electroforesis en campo pulsado (PFGE). La prevalencia general de Salmonella spp. en muestras fecales de aves fue baja (1,85%), observándose una proporción de muestras positivas a Salmonella significativamente mayor en las aves capturadas en zonas próximas a cebaderos, sugiriendo que las granjas porcinas podrían actuar como amplificadores de la infección en las aves silvestres. Además, se observó que las aves son portadoras de serotipos potencialmente zoonóticos, especialmente de S. Typhimurium, y asociados con resistencias a antibióticos. Con el fin de seguir avanzando en la epidemiología de la infección en los cebaderos y a la vista de los resultados obtenidos en la anterior publicación, el objetivo de la Publicación 3 (Role of wild bird and rodents in the epidemiology of subclinical salmonellosis in finishing pigs) fue determinar el papel que las aves y roedores silvestres podían jugar en la dinámica de infección de la salmonelosis subclínica porcina en dichos cebaderos. De las 41 explotaciones muestreadas para este fin, en el 21,9% se detectaron aves que eliminaban Salmonella spp. Aunque la mayoría (74%) de estos aislados resultaron susceptibles a todos los antibióticos testados. Los aislados que presentaban resistencias coincidían en sus patrones con los obtenidos a partir de muestras fecales de cerdos de la misma granja. Aunque el número de granjas en las que se capturaron roedores fue bajo (n=13), en casi la mitad de ellas (46,2%) se aisló Salmonella spp. de estos animales. Además, el serotipo más prevalente en estas muestras lo era también en las muestras de heces de porcino (S. Typhimurium). Se hace evidente que tanto las actividades de higiene como las medidas de bioseguridad que eviten el contacto entre estos animales silvestres y los cerdos ayudarían a controlar la salmonelosis en los cebaderos porcinos. Salmonella Typhimurium y su variante monofásica (S. 4,[5],12:i:-) son los serotipos más comúnmente observados en porcino de cebo. En Europa S. Typhimurium es uno de los principales serotipos asociados con la salmonelosis humana y su variante monofásica se considera un serotipo emergente. El objetivo de la Publicación 4 (Characterization of Salmonella enterica serovar Typhimurium isolates from pigs and pig environment-related sources and evidence of new circulating monophasic strains in Spain) fue caracterizar los aislados de S. Typhimurium y S. 4,[5],12:i:- que se habían obtenido en los distintos estudios epidemiólogicos realizados por nuestro grupo de investigación, tanto en cerdos como en animales silvestres, con la finalidad de conocer su diversidad genética y fenotípica. Mediante pruebas fenotípicas (fagotipificación y test de resistencia a antibióticos) y moleculares (Análisis de variabilidad de secuencias Multi Locus -MLVA-), se analizaron un total de 117 aislados de S. Typhimurium y 59 de S. 4,[5],12:i:- obtenidos a partir de muestras de cerdos (heces y NLM), aves (heces) y roedores (intestino, bazo e hígado) y de muestras ambientales obtenidas en las granjas porcinas. Los resultados obtenidos sugieren que estamos ante la emergencia de nuevas cepas de S. 4,[5],12:i:-, con gran poder de difusión, y más próximas fenotípica y genotípicamente a los aislados europeos que a la cepa inicialmente descrita en España. Casi la totalidad de estas cepas eran resistentes a dos o más clases de antibióticos. Tanto el uso indiscriminado de antibióticos en salud humana como su utilización a dosis subterapéuticas como promotores del crecimiento en los animales de abasto, ha permitido que las bacterias desarrollen mecanismos de resistencia a dichos antibióticos. Este hecho se ha convertido en un problema de salud pública, lo que ha motivado que desde el 1 de Enero de 2006 la UE prohibiese el uso de los antibióticos como promotores del crecimiento (Reglamento CE nº 1831/2003). En el caso de Salmonella spp. el número de cepas resistentes ha aumentado, siendo frecuente su aislamiento en muestras tanto humanas como animales o de alimentos. En los tres estudios anteriores se comprobó que el porcentaje de aislados de Salmonella spp. que presentaban resistencias antimicrobianas era muy elevado, lo que ponía de manifiesto la necesidad del uso de medidas alternativas a los antibióticos que ayuden al control de la infección por Salmonella spp. en las explotaciones porcinas. Por este motivo se diseñó el trabajo que se muestra en la Publicación 5 (Reduction of subclinical Salmonella infection in fattening pigs after dietary supplementation with a β-galactomannan oligosaccharide) cuyo objetivo fue evaluar el efecto que tiene sobre la infección y eliminación de Salmonella spp. la adición en la dieta de cerdos de engorde de distintas concentraciones de un oligosacárido β-galactomanano (β-GMOS; Salmosan®, ITPSA, Barcelona, Spain) obtenido de la semilla del algarrobo (Ceratonia siliqua). Para llevar a cabo este estudio se realizaron tres pruebas de campo independientes, en cada una de las cuales se probó una dosis distinta del aditivo: 0,5, 3 y 2 kg de β-GMOS, respectivamente, por tonelada de pienso durante todo el periodo de cebo. Para cada prueba se estableció un grupo control (CG) que recibía el mismo pienso sin el aditivo. Se obtuvieron muestras de suero y heces de los animales durante la fase de cebo así como en el sacrificio, momento en el que, además, se obtuvieron muestras de NLM. Los resultados microbiológicos mostraron que cuando se utilizaban dosis altas del β-GMOS las prevalencias de infección (NLM positivos) y de eliminación (muestras fecales positivas) eran significativamente menores (P<0,01) en los grupos que habían recibido el tratamiento que en los controles. Los resultados serológicos mostraron que sólo cuando se utilizaba la dosis más alta del β-GMOS (3 Kg/t de pienso), la seroprevalencia era significativamente menor en el grupo tratamiento que en el grupo control. Un dato interesante a destacar es que todas las cepas en las que se determinó el perfil de resistencia a antibióticos mostraron resistencia a, al menos, dos clases distintas de antibióticos. Los resultados obtenidos en los distintos estudios realizados en esta Tesis Doctoral nos han permitido adquirir un mayor conocimiento en aspectos claves de la salmonelosis porcina como son el diagnóstico, la epidemiología y el control. En primer lugar, se ha determinado la sensibilidad del método diagnóstico, dato de suma importancia a tener en cuenta para el éxito de los programas de control y para la mejora de los estudios epidemiológicos. Por otro lado, se ha comprobado que las aves silvestres y roedores pueden jugar un papel fundamental en el mantenimiento de la salmonelosis en las explotaciones porcinas, como portadores de serotipos zoonóticos y altamente resistentes a los antibióticos. Además, se ha puesto de manifiesto la emergencia en estas explotaciones de nuevas cepas de la variante monofásica de Salmonella Typhimurium. Y, finalmente, se ha evaluado la eficacia del empleo de determinados extractos naturales de plantas, en concreto de un galactomanano, para el control de la infección en la granja. Las conclusiones de este trabajo son las siguientes: 1. Se ha estimado por primera vez la sensibilidad de la norma ISO 6579:2002/Amd1:2007 para el aislamiento de Salmonella spp. a partir de NLM de cerdo. Nuestros resultados indican que esta sensibilidad fue relativamente alta (87,6%), por lo que resulta una técnica aceptable para la determinación de la prevalencia de infección por Salmonella spp. en poblaciones de cerdos destinados a matadero. Asimismo, la técnica de PCR descrita podría emplearse como método complementario para el diagnóstico de la salmonelosis, dada su mayor rapidez y similar sensibilidad. 2. Aunque, en general, la prevalencia de salmonelosis subclínica en aves silvestres fue baja, ésta resultó aproximadamente 16 veces superior en aves silvestres asociadas con granjas porcinas. Las granjas porcinas podrían actuar como amplificadores de la infección en las aves al favorecer su congregación. Los patrones migratorios y la dieta de las aves silvestres también son factores que podrían influir en la transmisión de la infección. 3. Algunos de los serotipos de Salmonella spp. aislados en las aves silvestres son zoonóticos y, además, portan resistencias a antibióticos. Estos dos factores deberían tenerse en cuenta en el estudio de la epidemiología de esta infección por el riesgo de que sean transmisores de la infección tanto de forma directa como de forma indirecta a humanos. 4. La diseminación de Salmonella spp. en las granjas porcinas estaría relacionada con la presencia de roedores y aves silvestres en las mismas. El papel de los roedores sería probablemente más relevante, debido tanto a la mayor prevalencia encontrada en ellos comparada con la hallada en aves, como por el alto grado de homología observado entre los aislados de Salmonella de roedores y cerdos. 5. La caracterización fenotípica y genotípica de los aislados de S. Typhimurium y de S. 4,[5],12:i:- pone de manifiesto la aparición de nuevas cepas del serotipo monofásico, más cercanas fenotípica y genotípicamente a las cepas europeas que a las inicialmente aisladas en España. Estas cepas poseen una gran capacidad para propagarse entre hospedadores de diferentes especies animales y presentan resistencia a un gran número de antibióticos. 6. La adición en la dieta de dosis superiores a 2 kg/t de pienso de un β-galactomanano durante todo el periodo de cebo permitió disminuir de forma significativa la prevalencia de infección y excreción de Salmonella spp. en los cerdos al sacrificio. Por ello, la utilización de este producto podría plantearse como una herramienta complementaria eficaz para el control de esta infección en la explotación y por consiguiente, en la cadena alimentaria. Sin embargo, queda por evaluar el coste económico de este enfoque. 7. Un hecho general a destacar de los resultados obtenidos en todos los estudios realizados, ha sido el alto grado de resistencia a antibióticos encontrado en los aislamientos bacterianos, y especialmente en el caso del serotipo S. 4,[5],12:i:-. El perfil de multi-resistencia ASSuT fue el más frecuente.