Papel de los protozoos en el reciclaje de proteína microbiana en el rumen

Zusammenfassung

RESUMEN Los protozoos suponen hasta la mitad de la masa microbiana del rumen (Dehority, 2003). La población protozoaria influye sobre el tamaño, composición y actividad de la población bacteriana, pero además ejerce un papel beneficioso sobre la salud, nutrición y productividad del rumiante como hospedador (Williams y Coleman, 1992). La mayor parte de la actividad proteolítica de los protozoos está relacionada con su capacidad de predar y digerir bacterias, lo que aumenta el reciclaje de proteína en el rumen y disminuye la contribución microbiana a la proteína que llega al duodeno. En los rumiantes, la mayor parte de la proteína digerida y absorbida en el duodeno es de origen microbiano, variando su contribución del 50 al 80% en función del aporte de proteína alimentaria no degradable y de la eficiencia del crecimiento microbiano durante la fermentación ruminal (Bach et al. 2005) Todas las especies de protozoos tiene capacidad para la predación de bacterias, pero dicha capacidad puede variar ampliamente entre las diversas especies (Coleman 1980). Se desconoce si la predación depende de la relación cualitativa y cuantitativa entre las especies de protozoos, si existe una selección de determinadas especies bacterianas por parte de los protozoos, o en qué medida esta acción está condicionada por la dieta o las condiciones ambientales del rumen. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la dieta sobre el proceso de predación bacteriana por parte de los protozoos y comprobar si existe selección bacteriana por parte de los protozoos ruminales. Como paso previo, en los dos primeros experimentos de Tesis (M1 y M2) se llevó a cabo la puesta a punto de la técnica de doble tinción de fluorescencia y de la metodología de cultivo para Entodinium caudatum y Diploplastron affine, aplicándolas para ello al estudio del comportamiento metabólico de los protozoos en el método de criopreservación. Se incluyó un seguimiento de los cultivos descongelados durante 96 horas para comprobar la capacidad de supervivencia de las células a corto y medio plazo. El método desarrollado fue efectivo y se obtuvieron recuperaciones de 0.503 con E. caudatum y 0.19 con D. affine con respecto al número de células criopreservadas. La doble tinción de fluorescencia resultó ser una técnica rápida y sensible de las alteraciones en la viabilidad de las especies estudiadas. En el tercer experimento incluido en esta Tesis (E1), se utilizaron inóculos mixtos de protozoos ruminales incubados con bacterias ruminales vivas o sometidas a distintos procesos de inactivación (aireación y antibióticos) y se estudio su actividad predatoria en incubaciones con dos tipos de proteína, soluble e insoluble. Los resultados de viabilidad hasta las 48 h mostraron un bajo o nulo efecto de los antibióticos sobre los protozoos ruminales (0.527 en CHL y 0.456 en STR frente a 0.425 en NOB), pero sí se observó una fuerte dependencia de los protozoos a la presencia bacteriana, independientemente del tipo de proteína suplementada. El cuarto experimento de tesis (E2) fue planteado para estudiar el efecto de la dieta y el tipo de N suplementado sobre la predación en comunidades mixtas de protozoos. En un primer ensayo in vitro se utilizaron una dieta forrajera y otra con una alta proporción de concentrado. Se aislaron y separaron protozoos ruminales en dos fracciones, según el tamaño, y se incubaron con bacterias marcadas con 15N. En una segunda fase, se sustituyó la alfalfa por paja de cereal en la dieta mixta y se realizó una incubación de protozoos in situ en rumen de ovejas marcadas con 15N, para estimar el ritmo de predación en función de su enriquecimiento isotópico. En el primer ensayo la dieta mixta indujo unos niveles superiores de predación en protozoos de menor tamaño (enriquecimiento en 15N de 0.0581 en dieta mixta frente a 0.0172 en forrajera, en los residuos de SP), mientras que el tipo de N suplementado no afectó a la predación. En el segundo ensayo, los protozoos de mayor tamaño incorporaron menos N bacteriano en las dietas basadas en paja de cereal y concentrado (0.992 mg de 15N bacteriano en dieta mixta de paja frente a 1.706 en dieta forrajera). En el quinto experimento de Tesis (E3) se estudió la capacidad predatoria selectiva de tres especies de protozoos de diverso tamaño y actividad metabólica, Entodinium caudatum, Diplodinium dentatum y Metadinium medium, frente a dos bacterias ruminales que cumplen papeles importantes en situaciones dispares en el rumen, Ruminococcus albus y Streptococcus bovis, mediante su incubación conjunta durante 210 minutos. La predación fue estimada mediante el uso de herramientas moleculares (qPCR). Se analizó la presencia de DNA bacteriano, tanto de bacterias totales como de las bacterias puras incubadas, en el interior de los protozoos. Metadinium medium mostró mayor capacidad predatoria que las otras dos especies de protozoos (3.27 ¿g de DNA bacteriano por mm3 de protozoo en M. medium, frente a 1.54 en D. dentatum y 1.45 en E. caudatum después de 210 minutos), y en ninguno de los casos se observó una claro comportamiento selectivo frente a las especies bacterianas utilizadas en este experimento. En el último experimento de Tesis (E4), se estudió la predación selectiva de la bacteria patógena Salmonella enterica por parte de la especie Entodinium caudatum. Se utilizó contenido ruminal de animales monofaunados con Entodinium caudatum así como animales defaunados y una cepa de bacteria modificada genéticamente para portar un gen de producción de fluorescencia y otro de resistencia al cloranfenicol. Tras incubar la bacteria con el protozoo durante 105 minutos, se estimó la emisión de fluorescencia como índice de predación, así como el crecimiento del residuo de sonicación de protozoos en medios de cultivo como índice de supervivencia intraprotozoaria. Se añadió cloranfenicol al medio para minimizar el crecimiento de otras especies bacterianas. La predación de E. caudatum sobre S. enterica fue efectiva y aumento con el tiempo de incubación, mientras que la supervivencia intraprotozoaria supuso una proporción del 0.0032 sobre el número de bacterias ingeridas después de 105 minutos de incubación. La predación de Entodinium caudatum sobre Salmonella enterica es efectiva y puede ejercer un papel importante en la prevención de patologías asociadas a dicha bacteria. SUMMARY Protozoa comprise up to the half of the total microbial mass within the rumen (Dehority, 2003). Protozoal community have an influence on the size, composition and bacterial activity, but also have a beneficial role on the health, nutrition and productivity of the ruminant host (Williams y Coleman, 1992). Most of the proteolytic protozoal activity is related with its ability to engulf and digest bacteria, and therefore, the protein recycling within the rumen is increased and the microbial N outflow to the duodenum is decreased. In the ruminants, most of absorbed protein in the duodenum is from microbial origin, contributing from 50 to 80%, depending on the dietary undegradable protein supply and the microbial growth efficiency during the ruminal fermentation (Bach et al. 2005). All protozoal species have capability to predate bacteria, but such capability can vary widely between the different species (Coleman 1980). It is unknown if predation depends on the qualitative and quantitative relationship between protozoal species, if there exist a selectivity of certain bacterial species by protozoa, or in which extent this activity is determined by the diet or the rumen environmental conditions. The main objective of this work was to evaluate the diet effect on the predation of bacteria by protozoa and to asses if there is a bacterial selectivity by rumen protozoa. As a previous step, in the two first experiments (M1 and M2), the double-stain fluorescence technique and the cultures media for Entodinium caudatum y Diploplastron affine were adjusted, using the cryopreservation procedure as the factor to study. The thawed cultures were monitored for 96 h to asses the survival ability of the protozoal cells in a short-medium period. The developed method was valid and recoveries of 0.503 in E. caudatum and 0.188 in D.dentatum cells were obtained, with respect to the number of cryopreserved cells. The double-stain of fluorescence was a fast and sensitive technique, useful to measure the viability changes of the studied species. In the third experiment (E1) mixed inocula of rumen protozoa was incubated with rumen bacteria either alive or inactivated through different processes (aireation and antibiotics) and their predatory activity was studied in media with two different sources of protein, soluble and insoluble. Viability results until 48 h of incubation showed a low or null effect of the antibiotics on the rumen protozoa (0.527 in CHL and 0.456 in STR, vs. 0.425 in NOB), but their numbers were strongly linked to the presence of bacteria, despite the type of supplemented protein. The forth experiment (E2) was planned to study the diet and type of N supplemented effects on the predation by mixed protozoal communities. In a first in vitro assay a diet based on roughage and a second one based on a high proportion of concentrate were used. Rumen protozoa were isolated and classified in two fractions according to the size and incubated with 15N-labelled bacteria. In a second trial, alfalfa was replaced by cereal straw in the mixed diet and an in situ incubation was performed within the rumen of 15N-labelled sheep, to estimate the predation rates, according to their isotopic enrichment. In the in vitro assay, the mixed diet induced a higher predatory activity in the small protozoa (15N-enrichment of 0.0581 in the mixed diet vs. 0.0172 in the alfalfa diet, in the SP residues), whereas the type of supplemented N did not affect the predation. In the second trial, large protozoa from the diet based on straw and concentrate incorporated less amount of bacterial N (0.992 mg of bacterial 15N incorporated in the mixed diet vs. 1.706 in the alfalfa diet) In the fifth experiment (E3) the ability of a selective predation was studied in three protozoal species, Entodinium caudatum, Diplodinium dentatum and Metadinium medium, with two rumen bacterial species, Ruminococcus albus and Streptococcus bovis , through a 210 minutes incubation. Predation was estimated by molecular tools (qPCR). Bacterial DNA was quantified both from total and pure incubated bacteria, within the protozoa. Metadinium medium showed a higher predatory capability than the two other species (3.27 ¿g of bacterial DNA per mm3 of protozoal in M. medium, vs. 1.54 in D. dentatum and 1.45 in E. caudatum cultures, after 210 min), and no selectivity was observed in any of the cases studied. In the last experiment (E4), predation of the pathogenic bacteria Salmonella enterica by the rumen protozoon Entodinium caudatum was studied. Rumen contents from monofaunated and defaunated sheep were used. Bacteria were genetically modified with a single-copy green fluorescent protein (GFP) gene and a chloramphenicol resistance gene. Bacteria and protozoa were both incubated for 105 minutes and fluorescence emission was estimated as a predation index, and the growth of sonicated residue of protozoa in culture media as an intraprotozoal survival index. Chloramphenicol was added to the media to minimize the growth of other bacterial species. Predation of S. enterica by E. caudatum was effective and increased with the incubation time, whereas the intraprotozoal survival comprised a proportion of 0.0032, when compared with the ingested bacteria after 105 minutes of incubation. Predation of S. enterica by E. caudatum is effective and can exert an important role in the prevention of pathologies associated to Salmonella enterica.