Acción de la interleuquina 1 beta(il-1b) en la fisiología intestinaltransporte de d-fructosa y actividad enzimática

Resum

La mucosa intestinal juega un importante papel en la protección del organismo frente a patógenos presentes en la luz y moléculas antigénicas. La pared intestinal está formada por el mucus que secreta y las propias células epiteliales, que sirve como una barrera selectiva que permite el paso de nutrientes, iones y otros solutos que ayudan a mantener la homeostasis del medio interno. Situaciones patológicas como la inflamación intestinal, sepsis, etc causan alteraciones en esta barrera. Las bacterias y sus productos de lisis, como lippolysaccharide (LPS), pueden acceder a la circulación general e inducir una respuesta inflamatoria sistémica o incluso un fallo multiorgánico. El LPS es un componente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas. Una gran cantidad de bacterias y sus productos excretados/secretados tienen efectos directos sobre la membrana y pueden alterar su permeabilidad y el transporte de iones. Asimismo, pueden provocar la liberación de citoquinas y alterar directamente la función epitelial. En este sentido, la administración endovenosa de LPS produce la liberación del Factor de Necrósis Tumoral alfa (TNF-a) y de la Interleucina-1beta (IL-1ß). IL-1ß es una citoquina pleiotrópica producida por células del sistema inmune y de otros tipos celulares incluyendo las células endoteliales. Se libera durante las enfermedades inflamatorias e infecciosas, y posee actividades autocrinas, paracrinas y endocrinas. El objetivo del presente trabajo fue determinar el efecto agudo de la administración intravenosa de IL-1ß sobre la fisología intestinal en el conejo bajo dos aspectos como son la absorción intestinal de D-fructosa y la actividad enzimática. Se han utilizado dos modelos experimentales. En el primero, se eligió yeyuno de conejo. Esta parte de intestino delgado es la que presenta máxima absorción. Por otra parte, el sistema digestivo del conejo es similar al de los seres humanos y los resultados pueden ser extrapolados. Estos animales también son muy importantes en Aragón, la comunidad autónoma donde se llevaron a cabo los estudios. Con este modelo, utilizamos la vía de infección sistémica (administración intravenosa de la citoquina). El transporte de D-fructosa a través del yeyuno, fue estudiado mediante las siguientes técnicas de experimentación in vitro: - Acumulación tisular de sustrato en tejido entero, técnica de Crane-Mandelstam. - Medida de flujos transepiteliales mediante cámaras tipo Ussing. - Preparación de vesículas membranosas intestinales de borde en cepillo. - Medida de la expresión de proteínas por Western-blotting. Por otra parte, utilizamos células Caco-2, como segundo modelo experimental. Esto, nos permitió estudiar el transporte intestinal de D-fructosa sin la influencia de señales nerviosas y hormonales presentes en el modelo animal. Las células Caco-2 son una línea celular de intestino que fue aislada de carcinoma de colon humano. Estas células al llegar a la confluencia forman una monocapa de células polarizadas que presentan las mismas características morfológicas y funcionales que los enterocitos maduros y además, expresan numerosos transportadores implicados en funciones absortivas y secretoras. Utilizamos células Caco-2 del clón PD7, por presentar una alta expresión de los principales transportadores involucrados en la absorción de azúcares a nivel intestinal. La administración intravenosa (iv) de IL-1ß produjo en el animal sepsis con un aumento de la temperatura corporal. El examen histológico de yeyuno, realizado con microscopía óptica y electrónica, no mostró cambios en la estructura epitelial y en la membrana basal por efecto de la IL-1ß. En relación con la absorción del azúcar, el transporte intestinal de D-fructosa fue inhibido en los animales tratados. La citoquina redujo el flujo transepitelial mucosal-serosal y la entrada a través de vesículas membranosas del borde en cepillo del azúcar. La inhibición fue anulada por L-NAME (inhibidor de la óxido nítrico sintasa -NO-), pero no por la indometacina (inhibidor de la ciclooxigenasa 1 y 2). Los inhibidores fueron administrados iv 15 minutos antes de la IL-1ß. Los niveles de expresión de GLUT5 fueron similares en los tejidos intestinales de los dos grupos de animales pero los de ARNm fueron mayores en los animales tratados. En resumen, estos resultados podrían indicar que la IL-1ß, produce una reducción significativa en la actividad intrínseca de GLUT5 con la participación del mediador óxido nítrico. A continuación, se estudió la posible participación de vías de señalización intracelular en el efecto inhibitorio de la IL-1ß. Los inhibidores específicos del proteasoma y de la PKC, anularon completamente el efecto de la citoquina. Además, la activación de PI3K produjo el mismo efecto. Estos resultados fueron confirmados en células Caco-2. Por otro lado, la expresión de p-PI3K se incrementó por acción de la IL-1ß, mientras que la expresión de p-PKCa no se vió afectada significativamente. Los resultados sugieren que la IL-1ß podría regular la activación de las proteínas pPKCa 73, 55 y pPI3K y del factor NF-kB. Como consecuencia de la activación, la absorción intestinal de fructosa sería inhibida por una modificación en la inserción de GLUT5 en la membrana del borde en cepillo y/o por una alteración de la actividad funcional del transportador. El efecto de la citoquina es independiente de hormonas y estímulos nerviosos. Continuando con nuestra investigación anterior, el siguiente objetivo de este trabajo fue determinar la secuencia en la liberación de citoquinas, tras la administración endovenosa de LPS a los conejos, en relación a la absorción intestinal de D-fructosa. Los resultados muestran que el TNF-a y la IL-1ß actúan de forma sinérgica y que tras la administración del LPS, el TNF-a podría ser liberado antes que la IL-1ß. Por lo tanto, el bloqueo específico de citoquinas a nivel del receptor podría ayudar a construir estrategias terapéuticas para proteger y mejorar la absorción de nutrientes durante la sepsis. Inicialmente hemos mostrado que la administración intravenosa de IL-1ß, a los conejos, produces fiebre sin cambios en la integridad del epitelio intestinal. Sin embargo, en relación a la función intestinal, se observó una ligera disminución de la actividad disacaridasa. Por otro lado, las actividades mieloperoxidasa y fosfatasa alcalina del colon se incrementaron ligeramente. En yeyuno, la IL-1ßprodujo una reducción de la actividad de las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa. El anión superóxido y la actividad enzimática de la NADPH oxidasa también disminuyeron. Además, la IL-1ß incrementó la expresión colónica de ABCG2/BCRP. Por lo tanto, la IL-1ß a niveles compatibles con la respuesta aguda, modula la actividad enzimática de la mucosa en ausencia de estado inflamatorio.