Estudio sobre la transmisión del retrovirus jaagsiekte (jsrv), causante del adenocarcinoma pulmonar ovino, a través del calostro y de la leche

Resumen

EL ADENOCARCINOMA PULMONAR OVINO (APO, ADENOMATOSIS PULMONAR OVINA, JAAGSIEKTE) ES UNA NEOPLASIA CONTAGIOSA QUE AFECTA AL PULMÓN DE LOS OVINOS. ESTA ENFERMEDAD ESTÁ CAUSADA POR UN BETARETROVIRUS EXÓGENO DENOMINADO RETROVIRUS OVINO JAAGSIEKTE (JAAGSIEKTE SHEEP RETROVIRUS) O JSRV, QUE INDUCE UNA PROLIFERACIÓN NEOPLÁSICA DE LAS CÉLULAS EPITELIALES SECRETORAS DE LOS ALVEOLOS Y LOS BRONQUIOLOS. EL RECEPTOR DE SUPERFICIE CELULAR DEL JSRV, HYAL2, ESTÁ PRESENTE EN NUMEROSOS TIPOS DE CÉLULAS A LOS QUE ESTE VIRUS PUEDE INFECTAR. SIN EMBARGO, SU LTR ES PREFERENTEMENTE ACTIVO EN LOS NEUMOCITOS TIPO II Y EN LAS CÉLULAS CLARA, DONDE SE DESARROLLA EL TUMOR. LOS MODELOS EXPERIMENTALES SUGIEREN QUE LAS CÉLULAS DE ORIGEN DEL APO SON PRINCIPALMENTE ESTOS TIPOS CELULARES, PERO ACTUALMENTE NO SE CONOCE CÓMO SE GENERAN LOS TUMORES EN LAS OVEJAS INFECTADAS POR EL JSRV EN CONDICIONES NATURALES. EL APO HA SIDO DESCRITO EN NUMEROSOS PAÍSES DEL MUNDO, EN ALGUNOS DE ELLOS SE ENCUENTRA DE FORMA ENDÉMICA, COMO ES EL CASO DE ESPAÑA, Y ES IMPORTANTE ENTRE LOS PROCESOS RESPIRATORIOS CRÓNICOS DE LA ESPECIE OVINA. LA INCIDENCIA DE LA ENFERMEDAD CLÍNICA EN LOS REBAÑOS ENDÉMICAMENTE AFECTADOS ES GENERALMENTE DEL 2-5%, EL PERIODO DE INCUBACIÓN EN LOS CASOS NATURALES ES HABITUALMENTE MUY LARGO, DE MESES A AÑOS, Y SE CONSIDERA QUE LA MAYORÍA DE ESTOS CASOS CORRESPONDEN A OVINOS DE 2 A 4 AÑOS DE EDAD. EL GRADO DE SINTOMATOLOGÍA CLÍNICA DE LOS ANIMALES AFECTADOS DE APO ESTÁ RELACIONADO CON EL TAMAÑO DE LA NEOPLASIA Y EL CONSIGUIENTE GRADO DE AFECTACIÓN DE LA FUNCIÓN PULMONAR. LOS SIGNOS CARACTERÍSTICOS DE LOS ESTADIOS TERMINALES, EN LOS QUE ES POSIBLE LLEVAR A CABO UN DIAGNÓSTICO CLÍNICO DE LA ENFERMEDAD, PRINCIPALMENTE CONSISTEN EN DISNEA, RUIDOS RESPIRATORIOS HÚMEDOS, ABUNDANTE SECRECIÓN DE FLUIDO PULMONAR Y PÉRDIDA DE PESO. LA AUSENCIA DE UNA RESPUESTA INMUNE HUMORAL FRENTE AL VIRUS QUE SEA DETECTABLE HA IMPEDIDO EL DESARROLLO DE PRUEBAS SEROLÓGICAS DE DIAGNÓSTICO PRECLÍNICO DE LA ENFERMEDAD, PERO EL ESCLARECIMIENTO DE LA SECUENCIA GENÓMICA DEL JSRV HA HECHO POSIBLE EL DESARROLLO DE TÉCNICAS DE PCR QUE PERMITEN LA DETECCIÓN ESPECÍFICA DEL ADN PROVIRAL. MEDIANTE EL USO DE ESTAS TÉCNICAS ES POSIBLE DETECTAR EL JSRV EN FORMA DE PROVIRUS EN LOS NÓDULOS LINFÁTICOS, OTROS ÓRGANOS LINFOIDES Y EN LOS LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA ANTES DEL DESARROLLO DE LA LESIÓN PULMONAR, LO QUE PERMITE LA DETECCIÓN PRECLÍNICA DE ANIMALES INFECTADOS POR EL VIRUS MEDIANTE UN ANÁLISIS SANGUÍNEO. SIN EMBARGO, LAS TÉCNICAS DE PCR UTILIZADAS PARA LA DETECCIÓN DEL JSRV EN MUESTRAS SANGUÍNEAS PRESENTAN UNA ALTA ESPECIFICIDAD PERO UNA BAJA SENSIBILIDAD, LO QUE SUPONE UNA DIFICULTAD A LA HORA DE DETECTAR DE FORMA INDIVIDUAL A LOS ANIMALES INFECTADOS Y CLÍNICAMENTE SANOS DURANTE EL LARGO PERIODO DE INCUBACIÓN DE LA ENFERMEDAD. ESTÁ GENERALMENTE ACEPTADO QUE EN CONDICIONES NATURALES LA PRINCIPAL VÍA DE INFECCIÓN ES LA AERÓGENA A TRAVÉS DE LAS GOTAS DE AEROSOL Y DE LAS SECRECIONES RESPIRATORIAS PROCEDENTES DE LOS ANIMALES ENFERMOS, QUE CONTIENEN UNA GRAN PROPORCIÓN DE PARTÍCULAS VÍRICAS. SIN EMBARGO, OTRAS RUTAS DE TRANSMISIÓN PODRÍAN CONTRIBUIR A LA DIFUSIÓN DE LA ENFERMEDAD EN LOS REBAÑOS OVINOS. ASÍ, LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN DIVERSOS ESTUDIOS MUESTRAN QUE EN LOS REBAÑOS AFECTADOS PUEDE DETECTARSE, MEDIANTE EL ANÁLISIS SANGUÍNEO POR PCR, UN PORCENTAJE ELEVADO DE CORDEROS INFECTADOS, DURANTE LOS PRIMEROS MESES DE VIDA, Y QUE EL JSRV PODRÍA TRANSMITIRSE DE LAS OVEJAS A LOS CORDEROS DE FORMA PERINATAL A TRAVÉS DE LA VÍA LACTÓGENA. EL PRINCIPAL OBJETIVO DE ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN FUE CONFIRMAR Y ESTUDIAR EN CONDICIONES NATURALES LA TRANSMISIÓN DEL JSRV DE LAS OVEJAS INFECTADAS A SUS CORDEROS A TRAVÉS DE LAS SECRECIONES LÁCTEAS, ANALIZANDO LOS SUCESOS INICIALES ASOCIADOS A ESTA RUTA DE TRANSMISIÓN. PARTIMOS DE LA HIPÓTESIS DE QUE EL JSRV PUEDE LLEGAR HASTA LA GLÁNDULA MAMARIA DE LAS OVEJAS INFECTADAS, INFECTAR SUS SECRECIONES LÁCTEAS, ATRAVESAR LA BARRERA INTESTINAL DEL CORDERO TRAS LA INGESTIÓN DE ESTAS SECRECIONES Y FINALMENTE INFECTARLO. LA BÚSQUEDA DE INDICIOS QUE APOYASEN ESTA HIPÓTESIS SE LLEVÓ A CABO, EN PRIMER LUGAR, A TRAVÉS DEL ESTUDIO DE LA PRESENCIA DEL JSRV EN LAS CÉLULAS SOMÁTICAS TOTALES Y EN LAS POBLACIONES MAYORITARIAS DE LEUCOCITOS MONONUCLEARES (MACRÓFAGOS/MONOCITOS, LINFOCITOS B Y LINFOCITOS T CD4+ Y CD8+) DE LAS SECRECIONES LÁCTEAS DE UN GRUPO DE OVEJAS INFECTADAS DE FORMA NATURAL POR EL VIRUS PERO QUE NO MOSTRABAN MANIFESTACIONES CLÍNICAS DE APO (OBJETIVO 1). EN SEGUNDO LUGAR, SE ANALIZÓ LA PRESENCIA DEL JSRV EN LOS LEUCOCITOS DE LA SANGRE PERIFÉRICA Y EN LOS TEJIDOS (DUODENO, YEYUNO, ÍLEON TERMINAL CON PLACAS DE PEYER, NÓDULOS LINFÁTICOS MEDIASTÍNICOS Y MESENTÉRICOS, PULMÓN Y TONSILA) DE LOS CORDEROS NACIDOS DE ELLAS Y AMAMANTADOS DE FORMA NATURAL CON EL CALOSTRO Y LA LECHE MATERNOS, QUE FUERON EUTANASIADOS A EDADES MUY TEMPRANAS, ENTRE LAS 12 HORAS Y LOS 10 DÍAS DE VIDA (OBJETIVO 2). ADEMÁS, LA INVESTIGACIÓN SE COMPLETÓ MEDIANTE LA EVALUACIÓN DE LA DISTRIBUCIÓN DEL JSRV EN LAS OVEJAS INFECTADAS ESTUDIADAS (OBJETIVO 3), SOBRE LAS CÉLULAS DE LA SERIE BLANCA DE LAS MUESTRAS DE ASPIRADOS DE MÉDULA ÓSEA Y DE SANGRE TOMADAS DE FORMA PAREADA Y PERIÓDICA IN VIVO, Y SOBRE DIVERSOS TEJIDOS TOMADOS POST MORTEM DURANTE LA NECROPSIA, ENTRE LOS QUE SE INCLUÍAN MUESTRAS DE GLÁNDULA MAMARIA, DE MÉDULA ÓSEA Y DE NÓDULOS PULMONARES SOLITARIOS SOSPECHOSOS DE APO DETECTADOS EN ALGUNAS DE ELLAS. EL ESTUDIO DE LOS ASPIRADOS DE MÉDULA ÓSEA INCLUYÓ, ADEMÁS, LA EVALUACIÓN DE SU UTILIDAD COMO PRUEBA DE DIAGNÓSTICO PRECLÍNICO FRENTE A LOS ANÁLISIS SANGUÍNEOS DISPONIBLES ACTUALMENTE, QUE SON POCO SENSIBLES A LA HORA DE DETECTAR INDIVIDUOS INFECTADOS PERO CLÍNICAMENTE SANOS. POR OTRO LADO, SOBRE LOS NÓDULOS PULMONARES SOLITARIOS DE APO TAMBIÉN SE LLEVÓ A CABO UN ESTUDIO DE SU COMPOSICIÓN CELULAR, PARA DETERMINAR LOS TIPOS CELULARES QUE ESTÁN INFECTADOS POR EL VIRUS EN ESTOS ESTADIOS TEMPRANOS DEL DESARROLLO TUMORAL Y CONTRIBUIR AL ESCLARECIMIENTO DE CÓMO SE INICIAN LOS TUMORES EN CONDICIONES NATURALES. EL ADN PROVIRAL DEL JSRV FUE DETECTADO MEDIANTE PCR EN LAS CÉLULAS SOMÁTICAS TOTALES DE LOS DISTINTOS TIPOS DE MUESTRAS DE SECRECIONES LÁCTEAS ANALIZADAS (PRECALOSTRO, CALOSTRO Y LECHE), EN 10 DE LAS 22 OVEJAS INFECTADAS ESTUDIADAS. SIN EMBARGO, SE OBSERVÓ UNA FALTA DE REPETIBILIDAD EN LOS RESULTADOS POSITIVOS A LO LARGO DEL TIEMPO, LO QUE PARECE INDICAR QUE LA PROPORCIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS DEL CALOSTRO Y DE LA LECHE QUE CONTIENEN EL ADN PROVIRAL DEL JSRV ES MUY BAJA. EN LO QUE RESPECTA AL ESTUDIO DE LAS POBLACIONES MAYORITARIAS DE LEUCOCITOS MONONUCLEARES, EL ADN PROVIRAL PUDO SER DETECTADO MEDIANTE PCR EN LA POBLACIÓN DE MACRÓFAGOS DE 3 DE LAS 8 OVEJAS ANALIZADAS, AUNQUE EL NÚMERO DE RÉPLICAS POSITIVAS FUE MUY BAJO (1/6 Ó 2/6), LO QUE INDICARÍA UNA FRECUENCIA DE INFECCIÓN REDUCIDA. ESTE HALLAZGO MUESTRA QUE LOS MACRÓFAGOS DE LAS SECRECIONES LÁCTEAS PUEDEN ESTAR INFECTADOS POR EL JSRV, LO QUE PODRÍA SUPONER UNA ESPECIAL IMPLICACIÓN DE ESTA POBLACIÓN CELULAR EN LA TRANSMISIÓN DEL VIRUS A TRAVÉS DE LA VÍA LACTÓGENA. SIN EMBARGO, NO SE PUEDE DESCARTAR LA CONTRIBUCIÓN DE LAS POBLACIONES LINFOCITARIAS ESTUDIADAS, QUE FUERON NEGATIVAS MEDIANTE PCR EN TODOS LOS CASOS ANALIZADOS, AUNQUE ESTOS RESULTADOS APUNTAN A QUE EN CASO DE ESTAR INFECTADOS POR EL VIRUS LA FRECUENCIA DE INFECCIÓN SERÍA MENOR QUE LA DE LOS MACRÓFAGOS. EL JSRV FUE DETECTADO EN LOS TEJIDOS Y/O EN LOS LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE UN TOTAL DE 9 DE 36 CORDEROS NACIDOS DEL GRUPO DE OVEJAS INFECTADAS Y QUE FUERON AMAMANTADOS DE FORMA NATURAL CON EL CALOSTRO Y LA LECHE MATERNOS. EN CONCRETO, UTILIZANDO TÉCNICAS DE INMUNOHISTOQUÍMICA Y DE HIBRIDACIÓN IN SITU EL VIRUS SE DETECTÓ EN UN ESCASO NÚMERO DE CÉLULAS CON MORFOLOGÍA LINFORRETICULAR EN LAS PLACAS DE PEYER (PERO NO EN LAS CÉLULAS EPITELIALES DE LAS VELLOSIDADES) DE 2 CORDEROS DE 12 HORAS Y DE OTROS 2 DE 24 HORAS DE VIDA, Y EN LAS MUESTRAS DE NÓDULOS LINFÁTICOS MESENTÉRICOS DE 4 ANIMALES DE ENTRE 72 HORAS Y 10 DÍAS DE EDAD. ADEMÁS, EL ADN PROVIRAL DEL JSRV SE DETECTÓ MEDIANTE PCR EN LOS LEUCOCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE 2 CORDEROS, DE 72 HORAS Y 10 DÍAS DE VIDA. POR OTRO LADO, HUBO UNA FALTA DE DETECCIÓN DEL JSRV EN LOS OTROS TEJIDOS ANALIZADOS, ENTRE LOS QUE SE ENCONTRABAN LAS MUESTRAS DE PULMONES Y DE NÓDULOS LINFÁTICOS MEDIASTÍNICOS. ESTOS DATOS IMPLICAN QUE EL VIRUS HA LLEGADO A LOS CORDEROS A TRAVÉS DE LA VÍA LACTÓGENA Y QUE LA POSIBILIDAD DE QUE SE HUBIESEN INFECTADO POR LA VÍA RESPIRATORIA ES REMOTA. EL ESTUDIO INMUNOHISTOQUÍMICO DE LAS MUESTRAS DE GLÁNDULA MAMARIA TOMADAS EN LAS NECROPSIAS REALIZADAS AL GRUPO DE OVEJAS INFECTADAS, REVELÓ ÚNICAMENTE EN 2 DE ELLAS LA PRESENCIA DE UN NÚMERO MUY REDUCIDO DE CÉLULAS CON UNA MORFOLOGÍA LINFORRETICULAR POSITIVAS AL JSRV. EN NINGÚN CASO SE DETECTÓ POSITIVIDAD EN LAS CÉLULAS EPITELIALES DEL TEJIDO MAMARIO, POR LO QUE PARECE IMPROBABLE LA MULTIPLICACIÓN DEL VIRUS EN ESTE TIPO DE CÉLULAS, COMO SÍ SUCEDE CON OTROS RETROVIRUS, COMO EL VIRUS DEL MAEDI-VISNA (MVV) O EL VIRUS DEL TUMOR MAMARIO DEL RATÓN (MMTV), PARA LOS QUE LA VÍA LACTÓGENA ES UNA RUTA IMPORTANTE DE TRANSMISIÓN. TODO ELLO PARECE INDICAR UNA AUSENCIA DE PARTICIPACIÓN DE LA GLÁNDULA MAMARIA EN EL CICLO BIOLÓGICO DEL VIRUS Y REDUCIRÍA LA PROBABILIDAD DE EXCRECIÓN DE PARTÍCULAS LIBRES DE JSRV EN LAS SECRECIONES LÁCTEAS. LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LAS MUESTRAS DE SECRECIONES LÁCTEAS Y DE GLÁNDULA MAMARIA DEL GRUPO DE OVEJAS INFECTADAS POR EL JSRV, Y EN LAS MUESTRAS DE SANGRE Y TEJIDOS DE LOS CORDEROS NACIDOS DE ELLAS Y AMAMANTADOS DE FORMA NATURAL CON EL CALOSTRO Y LECHE MATERNOS, DEMUESTRAN QUE EL JSRV ES CAPAZ DE ATRAVESAR LA BARRERA INTESTINAL DE LOS CORDEROS NEONATOS (QUE ES PERMEABLE A LAS CÉLULAS DEL CALOSTRO DURANTE LAS PRIMERAS HORAS DESPUÉS DEL NACIMIENTO) ASOCIADO A LAS CÉLULAS DEL CALOSTRO EN LAS QUE SE ENCUENTRA EN FORMA DE PROVIRUS (ENTRE LAS QUE LOS MACRÓFAGOS PODRÍAN TENER UNA ESPECIAL IMPLICACIÓN) Y ALCANZAR SUS PLACAS DE PEYER, SUS NÓDULOS LINFÁTICOS MESENTÉRICOS Y LLEGAR A LA CIRCULACIÓN SANGUÍNEA PERIFÉRICA. TODO ELLO CONFIRMA QUE LA INGESTIÓN DE CALOSTRO CONSTITUYE UN MODO DE TRANSMISIÓN DEL JSRV DE LAS OVEJAS A SUS CORDEROS EN CONDICIONES NATURALES. EN LO QUE RESPECTA AL ESTUDIO DE LA MÉDULA ÓSEA DE LAS OVEJAS INFECTADAS POR EL JSRV LLEVADO A CABO SOBRE MUESTRAS TOMADAS IN VIVO Y POST MORTEM, EL ADN PROVIRAL NO PUDO SER DETECTADO MEDIANTE PCR EN NINGUNA DE LAS RÉPLICAS DE NINGUNA DE LAS MUESTRAS DE ASPIRADOS DE MÉDULA ÓSEA ANALIZADAS, PERO SÍ EN ALGUNAS DE LAS MUESTRAS DE SANGRE TOMADAS DE FORMA PAREADA. SIN EMBARGO, EL EXAMEN INMUNOHISTOQUÍMICO DE LAS SECCIONES DE LAS MUESTRAS DE MÉDULA ÓSEA TOMADAS DURANTE LAS NECROPSIAS, EVIDENCIÓ LA PRESENCIA DE CÉLULAS TEÑIDAS POSITIVAMENTE, AUNQUE EN UN NÚMERO MUY REDUCIDO. ESTOS RESULTADOS MUESTRAN QUE LA MÉDULA ÓSEA DE LOS ANIMALES INFECTADOS PERO ASINTOMÁTICOS PUEDE CONTENER CÉLULAS INFECTADAS POR EL JSRV, AUNQUE EN UNA ESCASA CANTIDAD, QUE PARECE ESTAR POR DEBAJO DEL LÍMITE DE DETECCIÓN DE LA PRUEBA DE PCR EMPLEADA, A PESAR DE QUE POSEE UNA ALTA SENSIBILIDAD Y DE QUE SE ANALIZÓ UN ELEVADO NÚMERO DE RÉPLICAS. POR ELLO, EL ANÁLISIS DE LOS ASPIRADOS DE MÉDULA ÓSEA MEDIANTE ESTA TÉCNICA, QUE NO PARECE SER MÁS SENSIBLE QUE EL ANÁLISIS DE PCR SANGUÍNEO, NO CONSTITUYE UN MÉTODO ÚTIL PARA EL DIAGNÓSTICO PRECLÍNICO DEL APO. AL REALIZAR LA NECROPSIA DE LAS OVEJAS INFECTADAS POR EL JSRV, EN 5 DE ELLAS SE DETECTÓ LA PRESENCIA DE PEQUEÑOS NÓDULOS PULMONARES SOLITARIOS DE 0,8-2,5 CM DE DIÁMETRO, QUE FUERON CONFIRMADOS HISTOLÓGICAMENTE COMO LESIONES INICIALES DE APO. EL ESTUDIO DE LA COMPOSICIÓN CELULAR DE ESTOS NÓDULOS REVELÓ QUE SE TRATABAN DE TUMORES MIXTOS Y QUE EN ELLOS HABÍA PRESENCIA DE CÉLULAS QUE EXPRESABAN MARCADORES DE CÉLULAS PROGENITORAS/MADRE LOCALES IMPLICADAS EN LA REPARACIÓN PULMONAR. ADEMÁS, SE DETECTÓ LA PRESENCIA DEL JSRV NO SOLO EN LAS CÉLULAS TRANSFORMADAS, SINO TAMBIÉN EN CÉLULAS CON MORFOLOGÍA LINFORRETICULAR LOCALIZADAS EN LAS ÁREAS INTERSTICIALES. TODO ELLO PODRÍA INDICAR QUE EL APO SE GENERA EN CONDICIONES NATURALES TRAS PRODUCIRSE CIERTOS DAÑOS PULMONARES ESPECÍFICOS, CON LA PARTICIPACIÓN ACTIVA DE ESTAS POBLACIONES CELULARES. PARA CONCLUIR, CABE DESTACAR LA NECESIDAD DE LLEVAR A CABO MÁS ESTUDIOS PARA TRATAR DE ESCLARECER CUÁL ES LA REPERCUSIÓN DE LA TRANSMISIÓN DEL JSRV A LOS CORDEROS A TRAVÉS DE LA VÍA LACTÓGENA, COMPROBAR SI SE MANTIENE EN ELLOS LA INFECCIÓN Y MEDIANTE QUÉ MECANISMOS TRAS LA INGESTIÓN DE LAS CÉLULAS DEL CALOSTRO MATERNO PORTADORAS DEL ADN PROVIRAL, Y DETERMINAR SI SE DESENCADENA Y CÓMO SE DESARROLLA LA FORMACIÓN DE LOS TUMORES DE APO TRAS LA INFECCIÓN DE LOS ANIMALES A TRAVÉS DE ESTA VÍA.