Caracterización y aplicación del regulador PAS-LuxR PimM como herramienta para el descubrimiento de nuevos fármacos

Resumen

En las últimas décadas, el descubrimiento de nuevas moléculas bioactivas ha disminuido de un modo preocupante, y este hecho unido a la mala praxis que se viene realizando de las mismas ha dado lugar a una falta de arsenal efectivo ante la cada vez mayor aparición de patógenos multirresistentes. Por esta razón, durante este siglo se están multiplicando los esfuerzos en buscar nuevos fármacos usando diferentes tipos de estrategias entre las que destaca la minería genómica. La aplicación de esta técnica unida al abaratamiento y los avances en técnicas de secuenciación de genomas ha permitido encontrar nuevas potencialidades a microorganismos que antaño se creían agotados. Así, mientras antes se consideraba que una cepa concreta podía producir una media de 3-4 compuestos con actividad biológica, ahora se sabe que esa misma cepa tiene información en su genoma para la producción de más de 20-30 compuestos bioactivos. La mayoría de las agrupaciones génicas de metabolitos secundarios están silentes en estas bacterias (no se expresan o lo hacen poco), y mediante su activación se puede lograr la producción de nuevas moléculas. Streptomyces es un género de bacterias cuya principal característica es la capacidad que posee para producir un amplio abanico de metabolitos secundarios. Dentro de este género, se encuentra una especie llamada S. natalensis capaz de producir un macrólido polieno llamado pimaricina que se caracteriza por poseer una actividad antifúngica relevante que ha sido aprovechada por diferentes industrias como la alimentaria, la agrícola o la farmacéutica. El avance en el estudio de los macrólidos polienos ha permitido descubrir que uno de los genes reguladores situados en la agrupación biosintética de la pimaricina, pimM, codifica un regulador PAS-LuxR que actúa como un activador transcripcional de la biosíntesis de este antifúngico, pero algo mucho más trascendental es que este tipo de reguladores no actúan solo como reguladores de sus respectivas agrupaciones génicas, sino que intervienen en multitud de procesos biológicos entre los que destaca la regulación de la biosíntesis de otros metabolitos secundarios. Teniendo en cuenta esta situación previa, se realizó un estudio sobre la activación de agrupaciones génicas durmientes por parte del regulador transcripcional PimM en diferentes cepas del género Streptomyces mediante la expresión heteróloga del vector pCPpimM. De 35 cepas ensayadas, se logró activar la producción de algún metabolito secundario con actividad antibacteriana o antifúngica en diez (S. albus J1074, S. ambofaciens DSM 40053, S. diastatochromogenes DSM 40449, S. durhamensis DSM 40539, S. griseofuscus DSM 40191, S. laurentii DSM 41684, S. leeuwenhoekii DSM 42122, S. longwoodensis DSM 41677, S. tsukubaensis NRRL 18488 y Streptomyces sp. FR-008) lo que supuso un éxito de casi el 29% de las cepas utilizadas. Cuando se procedió a caracterizar estas activaciones, los principales antifúngicos para los que se ha logrado activar su producción han sido antimicinas, candicidina y filipina, mientras que a nivel antibacteriano, se ha localizado una activación de un compuesto bioactivo contra S. aureus subsp. aureus CECT 5190, cepa hospitalaria habitual que presenta resistencia a meticilina. Por otra parte, se obtuvieron mutantes de pimM mediante PCR propensa a errores. De los 20 mutantes obtenidos, siete de ellos consiguieron mejorar las producciones de PimM originales siendo el mejor mutante el que denominamos 321, con producciones específicas de pimaricina 3,3 veces superiores a las obtenidas por el control demostrando que la evolución forzada de reguladores PAS-LuxR es un buen método para mejorar la producción de macrólidos polienos. Además, la realización de estos experimentos ha permitido realizar un estudio funcional de la proteína PimM demostrando que ciertas modificaciones en el dominio PAS son susceptibles de mejorar la producción del antifúngico dado que una de las funciones del dominio PAS es modular la afinidad del dominio HTH por sus dianas en el ADN, mientras que el dominio de unión a ADN LuxR es menos susceptible de ser modificado pues los cambios en el mismo tienen una alta probabilidad de llevar a la proteína a una pérdida de su funcionalidad.