Análisis funcional de regiones implicadas en la regulación transcripcional del gen de la [beta]-caseína ovina

Résumé

En este estudio se ha realizado un análisis funcional de regiones implicadas en la regulación transcripcional del gen de la beta-caseína en la especie ovina. Para ello, se ha aislado DNA de un animal de raza Churra y mediante combinación de amplificaciones por PCR y digestiones con enzimas de restricción, se han obtenido cuatro fragmentos que cubren las siguientes regiones del gen: -3633/+11, -2651/+11, -1799/+11 y -803/+11. Dichos fragmentos han sido clonados en el vector pBLCAT3. En los ensayos de actividad transcripcional, se han empleado las líneas celulares HC11 y MCF7, las cuales han sido transfectadas con las diferentes construcciones de la región reguladora. En condiciones basales, la región -1799/+11 ha manifestado la máxima actividad transcripcional en ambos tipos celulares. Con el fin de caracterizar esta región, se han subclonado dos fragmentos de la misma (-1738/-1437 y-1437/-803) en el plásmido pBLCAT2. La inserción de estas secuencias en posición 5' respecto al promotor basal heterólogo presente en este plásmido, ha determinado una reducción del 50-80, en la eficiencia de transcripción del gen CAT. Este efecto se ha evidenciado tanto en células epiteliales mamarias (HC11 y MCF7) como en células de origen no mamario (COS-( y CHO). Estos resultados sugieren la presencia de un elemento regulador negativo localizado en los fragmentos en estudio. Para analizar las posibles interacciones de estos fragmentos con proteínas reguladoras, se han llevado a cabo ensayos de retardo de la movilidad electroforética en gel y ensayos de protección frente a la digestión con DNasa I. En relación con la región -1738/-1437, se han detectado tres complejos DNA-proteínas en extractos celulares totales preparados a partir de las células HC11, MCF7, COS-7 y CHO. Estos factores proteicos podrían ser los mediadores de la acción reguladora negativa descrita. La actividad de estos factores no parece estar mo