Age effects on inflammation and necroptosis in a global cerebral ischemia model. A role for the endoplasmic reticulum stress

Resumen

El ictus o accidente cerebrovascular (ACV) es una de las principales causas de muerte e incapacidad y conlleva grandes gastos tanto sociales como económicos. Los supervivientes de un ictus normalmente presentan incapacidades motoras o cognitivas que reducen gravemente su nivel de vida. Entre los factores de riesgo del ictus la edad es el más importante, dado que la mayor parte de los casos de ACV se dan a partir de los 65 años, y su incidencia aumenta exponencialmente con la edad. El progresivo envejecimiento de la población ha supuesto un aumento en la incidencia de esta patología, lo que incrementa la urgencia en la búsqueda de nuevas terapias para paliar el daño isquémico. A pesar de que el proceso de envejecimiento provoca una serie de alteraciones que pueden llevar a una respuesta diferente frente al ACV, la mayor parte de los estudios entorno a la patología del ictus y la búsqueda de nuevas terapias se realiza en animales jóvenes. Éste trabajo se centra en el proceso neuroinflamatorio, que es en parte responsable de los procesos de muerte celular retrasada asociada a esta patología, en animales jóvenes y viejos. En concreto éste estudio analiza el proceso de necroptosis, una modalidad de muerte celular regulada (MCR) descrita recientemente y estrechamente relacionada con la respuesta inflamatoria. Para la realización de este trabajo se ha utilizado un modelo de isquemia cerebral global inducida mediante la oclusión de las carótidas en un estado hipotenso. Este modelo permite la comparación entre la corteza cerebral (cx) y el área hipocampal CA1, regiones que presentan diferente vulnerabilidad al daño isquémico. En el primer capítulo se analizan, mediante Western blot (WB) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), los principales marcadores de la señalización inducida por el receptor 1 del factor de necrosis tumoral (TNFR1) 48 y 72 horas después del ictus. Además, se analiza la pérdida neuronal 7 días después del ACV mediante inmunomarcado del antígeno neuronal NeuN. Nuestros datos indican que el ictus provoca necroptosis en la Cx, que esta respuesta comienza antes de las 48 horas y se mantiene al menos hasta las 72 horas de reperfusión. Algunos datos obtenidos en CA1, sugieren una respuesta necroptótica en esta región, sin embargo, los resultados obtenidos no permiten asegurarlo. La isquemia causa además estrés de retículo endoplasmático en la Cx, que ocurre simultáneamente a la inducción de la necorptosis, y cuya ejecución es paralela a una respuesta transcripcional mediada por NF-κB. La falta de activación de NF-κB en CA1 sugiere que la activación de NF-κB depende de la ejecución de la necroptosis. Además, dado que el alivio del estrés de retículo mediante la potenciación de la respuesta a las proteínas mal plegadas (UPR) inhibe la necroptosis y reduce la pérdida neuronal en la Cx, sugerimos que la necroptosis observada en esta área es dependiente del estrés de retículo. En el segundo capítulo se analiza el efecto del envejecimiento en la inflamación inducida por el ictus y se compara la respuesta entre la Cx y el CA1. La activación glial por el ictus se caracterizó a las 48 horas de reperfusión mediante análisis morfométricos y densitométricos de la microglía y la astroglía. Además, se caracterizó el fenotipo y la activación de la microglía mediante ensayos de qPCR. Los datos obtenidos en animales jóvenes muestran que, en la Cx, el ACV induce una polarización hacia ambos fenotipos microgliales, M1 y M2, mientras que en el CA1 solo se observa una polarización hacia el fenotipo M1. El envejecimiento altera la polarización de la microglía en el CA1, donde se puede observar cierta polarización hacia el fenotipo M2 asociado a la edad, pero no en la Cx, donde el envejecimiento, aunque altera la respuesta en algunos marcadores fenotípicos, no modifica sustancialmente la polarización. Estos datos sugieren una respuesta dependiente de la estructura asociada al envejecimiento, en la que la microglía del CA1 se ve más afectada que la microglía cortical. El ACV provoca una fuerte activación astroglial en la Cx que no se detecta en el CA1. Estos datos sugieren que la astrogliosis puede tener un papel en la diferente vulnerabilidad al daño isquémico observado entre estas regiones. Esta respuesta astroglial no se observa en los animales viejos, lo cual concuerda con el aumento en el daño isquémico asociado a la edad. Por último, el tercer capítulo se centra en los efectos del envejecimiento en la necroptosis inducida por el ACV. Para analizar el efecto de la edad en este tipo de MCR se midieron los principales marcadores de la ruta de señalización de TNFR1, mediante ensayos de WB y qPCR, tanto en animales jóvenes como en viejos, 48 horas después del ACV. Los resultados obtenidos en este estudio confirman que el ACV provoca necroptosis en la Cx, mientras que en CA1 podrían predominar otros tipos de MCR, como la apoptosis. Además, el envejecimiento acelera al menos 24 horas la progresión de la necroptosis en la Cx. El aceleramiento de la necroptosis parece depender de una menor expresión de las proteínas pro-supervivencia que regulan la señalización por TNFR1. Finalmente, los aumentos de algunos marcadores apoptóticos asociados a la edad en CA1, sugieren que la apoptosis es más relevante que la necroptosis en la muerte celular provocada por el ACV en esta área cerebral.