Biosíntesis de lisina en "Penicillium chrysogenum"caracterización genética y molecular de la enzima homocitrato sintasa

Abstract

El aminoácido lisina es sintetizado a través de la ruta de ácido alfa-aminoadípico en Penicillium chrysogenum. En este microorganismo, la ruta del alfa-aminoadipato juega un papel adicional, además de la biosíntesis de lisina, ya que suministra alfa-aminoadipato para la formación de penicilina. El primer paso de la ruta de biosíntesis de lisina, la formación de homocitrato por la enzima homocitrato sintasa, parece ser un punto clave en la regulación del flujo metabólico a través de la ruta. En esta memoria se recoge la caracterización genética y molecular de este paso enzimático. El gen que codifica la homocitrato sintasa, primera enzima de laruta de formación de lisina, de P. chrysogenum fue clonado, mediante hibridación heteróloga, y posteriormente secuenciado. Mediante electroforesis en geles de pulsos se separaron los cromosomas de varias estirpes de P. chrysogenum, y mediante hibridación se determinó la localización cromosómica del gen lys1 en las cepas estudiadas. La función del gen lus1, como gen que codifica la homocitrato sintasa, fue demostrada mediante la obtención de tres mutantes interrumpidos en dicho gen, mediante la técnica de doble recombinación. Los tres mutantes exhibieron auxotrofía de lisina y, únicamente, niveles residuales de actividad homocitrato sintasa. Se estudió mediante hibridación de ADN total de tres cepas de P. chrysogenum, el número de copias del gen lys1 en el genoma, comprobándose la existencia de una sola copia del gen lys1 en las tres cepas objeto de estudio. Esto, junto a los resultados obtenidos en los experimentos de interrupción genética, demostró que solamente existe un gen que codifique la enzima homocitrato sintasa en P. chrysogenum. En Saccharomyces cerevisiae existen dos isoenzimas de la homocitrato sintasa, ambas localizadas en el núcleo celular. Para estudiar la localización celular de la homocitra sintasa de P. chrysogenum, se construyó ungen