Grapevine root-associated actinobacteria as novel biocontrol agents against fungi involved in trunk diseases

  1. González García, Sandra
Supervised by:
  1. José Manuel Álvarez-Pérez Director
  2. Juan José Rubio Coque Director

Defence university: Universidad de León

Fecha de defensa: 10 May 2019

Committee:
  1. José Antonio Gil Santos Chair
  2. Laura Martín Blanco Secretary
  3. Helene Lunde Robertsen Committee member
Department:
  1. BIOLOGÍA MOLECULAR

Type: Thesis

Abstract

Las denominadas “enfermedades de madera de vid” son uno de los principales problemas a los que se enfrenta el sector vitivinícola en todo el mundo y que implica importantes pérdidas económicas. Dichas enfermedades son causadas por diferentes hongos patógenos afectando tanto a viñedos establecidos como a viñedos jóvenes. El aumento de la incidencia de las enfermedades de madera a lo largo de la última década se atribuye a la pérdida de estrategias efectivas de control y a los cambios en los métodos de producción, donde la mecanización ha provocado que la densidad de los viñedos haya aumentado considerablemente. Durante muchos años, la estrategia empleada para limitar el crecimiento de hongos patógenos fue el empleo de pesticidas de síntesis. Sin embargo, la toxicidad unida al riesgo para la salud, han limitado su uso. Al mismo tiempo, han emergido y emergen otras estrategias como el empleo de compuestos naturales o la aplicación de microorganismos beneficiosos que habitan de forma natural en el en la planta y su entorno. En esta línea, se ha llevado a cabo el aislamiento y caracterización de actinobacterias, tanto de la rizosfera como del sistema radicular de plantas jóvenes de vid, para su posterior aplicación como alternativa novedosa, prometedora y respetuosa medioambientalmente para combatir las infecciones causadas por hongos patógenos. En general, todas las cepas seleccionadas para el estudio mostraron una clara disminución en la tasa de aislamiento de hongos patógenos en comparación con las plantas no tratadas. Las dos cepas más prometedoras, una endofñitica (Streptomyces sp. VV/E1) y otra rizosférica (Streptomyces sp. VV/R4) fueron seleccionadas para llevar a cabo un análisis más exhaustivo. En este trabajo también se estudió la colonización de las dos cepas más prometedoras mediante el desarrollo de marcadores moleculares de tipo SCAR diseñados a partir de regiones poco conservadas del genoma de ambas cepas. Se analizaron dos métodos de colonización diferentes: inmersión del sistema radicular en una suspensión de actinobacterias e inyección directa de una suspensión de actinobacterias en el portainjertos. La detección y cuantificación de las actinobacterias en el material vegetal se analizó mediante PCR a tiempo real (qPCR) empleando los marcadores moleculares desarrollados. Aunque los dos métodos fueron efectivos en la colonización de la actinobateria, la opción más adecuada es la inoculación por inmersión ya que asegura una correcta implantación sin añadir pasos adicionales en el proceso de aplicación industrial. Ésta técnica también permitió el estudio del movimiento de la actinobacteria endofítica a lo largo de la planta, detectándose a lo largo del portainjertos hasta el segundo peciolo sin llegar a detectarse en la segunda hoja. Los genomas de las dos cepas seleccionadas fueron secuenciados para su posterior análisis in silico que condujo a la identificación de varias agrupaciones génicas que podrían estar implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios con actividad antifúngica. La manipulación génica de dichas agrupaciones génicas mediante CRISPR, junto con el análisis de enzimas extracelulares y otros metabolitos secundarios detectados por HPLC-MS en la cepa endofítica fueron los métodos empleados para dilucidar si estos compuestos estaban involucrados o no en la actividad de biocontrol. De este modo, compuestos como la antimicina, la candicidina o la maculosina, descritos como antifúngicos, no pudieron ser relacionados con el efecto de biocontrol mostrado por esta cepa en campo. De un modo similar, la producción de enzimas extracelulares del tipo de las quitinasas tampoco podría ser considerada como responsable de la actividad de biocontrol. A modo de resumen, las actinobacterias que colonizan la rizosfera y el aparato radicular de las plantas de vid son una importante fuente de agentes de biocontrol para reducir la incidencia de hogos patógenos de vid, y por tanto mejorar la calidad de las plantas en vivero y viñedo en todo el mundo. Sin embargo, la identificación de los principales compuestos bioactivos implicados en el proceso de biocontrol es una tarea ardua aún sin resolver.