Estudio de la susceptibilidad de la línea germinal masculina al daño genético y epigenético

Resumen

El espermatozoide ha pasado de ser considerado un mero portador de la información genética, que empezaría a expresarse en etapas relativamente avanzadas del desarrollo embrionario (transición materna-zigótica), a demostrarse como un protagonista esencial en el desarrollo futuro del embrión, al contener una serie de elementos epigenéticos cruciales para el éxito de la fecundación y el desarrollo temprano. En concreto, el conjunto de proteínas nucleares básicas espermáticas y sus modificaciones postraduccionales, la metilación del ADN, la presencia de ARNs codificantes y no codificantes y la presencia de proteínas de la matriz nuclear constituyen parte de la información epigenética contenida en el espermatozoide, que es transmitida al zigoto durante la fecundación. Tanto la información genética como la epigenética del espermatozoide son sensibles a la agresión de diferentes agentes externos. En particular, no solo es vulnerable el espermatozoide tras la eyaculación, sino que el propio proceso de espermatogénesis constituye una ventana de susceptibilidad genética y epigenética a tener en cuenta. Cualquier alteración que se produzca durante el proceso de formación del espermatozoide maduro puede afectar de diversas formas a las células de la línea germinal, lo que puede alterar la información recibida por el embrión en el momento de la fecundación e incluso transmitirse entre generaciones por vía paterna. Teniendo en cuenta la organización de la cromatina espermática, podrían existir áreas específicas del núcleo del espermatozoide menos protegidas frente al daño genético. Por ello, en el Primer Capítulo de esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de la relación entre la susceptibilidad al daño genético y la asociación de la cromatina espermática con diferentes proteínas nucleares. Para ello, se emplearon dos especies de vertebrados como modelo de estudio: trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) y pez cebra (Danio rerio), cuya cromatina espermática presenta un único tipo de proteína nuclear básica: protaminas en trucha e histonas en pez cebra Las muestras seminales fueron sometidas a diferentes tratamientos genotóxicos (irradiación UV, estrés oxidativo generado por H2O2 y criopreservación) y se valoró el daño genético a nivel global – mediante ensayo TUNEL – y a nivel específico en genes concretos localizados en regiones con diferente accesibilidad a la maquinaria de transcripción – mediante una evaluación por qPCR. Además, se determinó la localización en el núcleo espermático de la lesión oxidativa 8-OHdG tras los tratamientos, así como, su posible colocalización con proteínas nucleares mediante inmunocitoquímica. En los dos modelos empleados, la irradiación UV ocasionó el mayor nivel de daño en el ADN y en genes específicos y la lesión oxidativa se distribuyó de manera uniforme por el núcleo espermático. El peróxido de hidrógeno provocó una regionalización de la lesión oxidativa, restringiéndose a la periferia nuclear. Además, no se observó una colocalización total de la lesión oxidativa con las proteínas nucleares estudiadas. Estos resultados nos permitieron concluir que las diferencias de sensibilidad genética observadas no dependen de la presencia de proteínas nucleares básicas. En concreto, la accesibilidad de cada agente genotóxico al núcleo podría ser el mayor responsable en la distribución del daño del ADN espermático. A pesar de que los genes analizados no han podido establecerse como biomarcadores de daño genético global, estos estudios representan un punto de partida para el abordaje de nuevos posibles candidatos y permiten desarrollar técnicas más precisas en la detección del daño. Los resultados de este capítulo constituyen los dos primeros artículos derivados de esta Tesis Doctoral, uno de ellos publicado en la revista PLOS ONE y el otro bajo revisión en la revista Theriogenology. Así mismo, forman parte de un artículo de revisión publicado en la revista Aquaculture (ver ANEXO). El Segundo Capítulo de esta Tesis Doctoral se centra en el papel que puede tener la arquitectura nuclear en la distribución del daño genético en el gameto masculino de mamíferos. Para ello, se evaluó el efecto de los agentes genotóxicos analizados en el primer capítulo sobre muestras seminales humanas. El espermatozoide humano no presenta un solo tipo de proteína nuclear básica, sino que su cromatina se configura en tres dominios principales: ADN unido a histonas (HDNA), ADN unido a protaminas (PDNA) y ADN asociado a proteínas de la matriz nuclear. Las regiones HDNA (nucleosomales) y asociadas a proteínas de la matriz son consideradas las más sensibles a sufrir daño en mamíferos. De nuevo, usando una estrategia similar a la descrita unas líneas más arriba, observamos que la irradiación UV generó el mayor nivel de daño, tanto a nivel global como en genes específicos. El H2O2, además de promover un nivel de daño diferencial entre los genes analizados, provocó la localización de la lesión oxidativa en una región ecuatorial y subacrosómica del espermatozoide. Así mismo, la localización del daño oxidativo no coincidió ni con la de la histona H3 ni con la de una proteína de matriz nuclear, descartando, por tanto, la mayor sensibilidad al daño oxidativo asociada a la presencia de proteínas nucleares básicas o de la matriz nuclear del espermatozoide. La lesión oxidativa se distribuyó siguiendo el mismo patrón que una enzima antioxidante, concluyendo que las características propias de la cabeza del espermatozoide facilitan el acceso de los agentes genotóxicos a los territorios nucleares, promoviendo un nivel de daño diferencial entre ellos. Este estudio cuestiona una de las afirmaciones aceptadas en mamíferos en relación a la mayor sensibilidad a sufrir daño y descarta el uso de genes localizados en las regiones HDNA como biomarcadores de daño oxidativo del ADN. En la actualidad, los resultados de este capítulo se encuentran enviados para su publicación a la revista Asian Journal of Andrology. Dadas las repercusiones que puede tener la alteración de la línea germinal durante la espermatogénesis, en el Tercer Capítulo de esta Tesis Doctoral se exploró el efecto de un disruptor endocrino, ampliamente extendido en el medio ambiente, sobre machos de pez cebra. En particular, se evaluó el efecto genético y epigenético del bisfenol A, usado de manera extensa en la producción de policarbonatos y resinas epoxi, sobre la espermatogénesis, centrando el foco de estudio en las posibles alteraciones de la información epigenética que será aportada al embrión en el momento de la fecundación. Para ello, se expusieron machos adultos de pez cebra durante todo el proceso de espermatogénesis a dosis de bisfenol A ambientalmente relevantes. Los resultados revelaron un descenso del número de espermatocitos, así como, un incremento de la apoptosis en testículo tras la exposición al tóxico. Así mismo, el bisfenol A incrementó la expresión del receptor de estrógenos gper1 y disminuyó la expresión de ccnb1 y sycp3 en testículo, lo que puede representar una alteración de la espermatogénesis y del proceso meiótico. El bisfenol A provocó un incremento de la actividad de las enzimas acetiltransferasas de histonas, así como, una hiperacetilación de histonas e hipermetilación de ADN. Estos resultados nos han permitido hipotetizar que el receptor GPER puede estar mediando los efectos promovidos por el BPA. Además, la exposición a bisfenol A causó un incremento de la fragmentación de la cromatina, una alteración del patrón epigenético y una modificación de los transcritos en los espermatozoides de los machos expuestos, lo que podría desequilibrar la información epigenética recibida por el embrión. Este es el primer estudio que revela un incremento de la acetilación de histonas en células testiculares tras la exposición a bisfenol A y su mantenimiento en las células espermáticas. Así mismo, ha puesto de manifiesto que dosis de bisfenol A, consideradas seguras en el agua de consumo hasta hace relativamente poco, son capaces de modificar el patrón epigenético espermático, lo que puede comprometer el desarrollo de la progenie futura. En la actualidad, estos resultados se encuentran enviados a la revista Environmental International para su revisión.