Mapa genético y análisis de secuencias nucleotídicas de interés en Lens

Resumen

Se ha elaborado un estudio en Lens mediante la utilización de marcadores moleculares basados en ADN y varios morfológicos para la construcción de mapas genéticos usando poblaciones (F2 y RIL) de un cruzamiento intersubespecífico entre la especie cultivada Lens culinaris ssp. culinaris del cultivar Lupa y la especie silvestre Lens culinaris ssp. orientalis BG 16880, utilizando tanto metodologías matemáticas para los diversos análisis de ligamiento como la novedosa técnica del mapeo por color. Para su consecución se estudiaron 835 marcadores moleculares desarrollados mediante las técnicas de detección de polimorfismos tipo SNP (polimorfismos de un único nucleótido) analizados mediante la utilización de la endonucleasa CEL I, CAPS (secuencias de restricción amplificadas y polimórficas) analizados mediante el uso de 17 enzimas de restricción distintas, RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar), SSR (repeticiones de secuencias cortas), SRAP (polimorfismos amplificados relacionados con secuencias), ISSR (polimorfismos entre microsatélites), SCAR (regiones amplificadas de secuencias caracterizadas) y variaciones observadas directamente en los productos de amplificación por PCR tanto de longitud como de presencia/ausencia. De esta forma se han conseguido un total de 7 mapas genéticos distintos , tanto de nueva construcción como por integración con otros mapas previos, permitiendo hacer estudios comparativos con otros trabajos mejorando el conocimiento del genoma de la lenteja. Esto unido a la diversidad de tipos de marcadores empleados, implica uno de los trabajos de ligamiento más exhaustivos en Lens. En estos mapas se incluyeron genes de interés como el gen para una quinasa de nucleósidos difosfato, gen de un componente del complejo de la piruvato deshidrogenasa y un gen inhibidor de la floración, correspondientes a los marcadores PNDKN1, LG093tq, y SSR- TFL1 respectivamente. Se analizaron varios productos de amplificación para observar similitudes con las bases de datos e identificar nuevas secuencias pertenecientes al genoma de la lenteja analizadas mediante distintas técnicas de detección de polimorfismos ya que correpondían a secuencias pertenecientes a EST (secuencias etiquetadas y expresadas), un gen análogo de resistencia (Pto-Kin) y el gen homólogo de floración TFL1 de Arabidopsis en lenteja. Se obtuvo la secuencia en lenteja del gen homólogo a TFL1 de Arabidopsis coincidiendo con la secuencia PsTFL1a de estudios realizados en guisante que corresponde a la función del gen DET (Determinate), que controla el inicio de la fase floral inhibiendo la transición desde la iniciación floral en el meristemo al estado de flor. Los análisis de alineamiento y filogenéticos realizados permiten clasificar a este gen en el grupo funcional TFL1-like dentro de la familia protéica PEBP o de proteínas de unión a fosfatidiletanolamina. El marcador SSR-TFL1 se ha desarrollado gracias al descubrimiento en esta tesis de una repetición del dinucleótido AT observada en la secuencia del intrón 2 del gen homólogo a TFL1 de Arabidopsis que ha permitido la inclusión de dicho gen en el mapa genético al ser polimórfico entre los parentales del cruzamiento analizado