Mapeo de alta densidad para la identificación de genes relacionados con la resistencia a las infecciones gastrointestinales por nematodos en el ganado ovino de raza churra

Résumé

La presente tesis doctoral se planteó una vez de que los SNP-chips estuvieron disponibles para la mayoría de las especies domésticas, incluyendo la oveja. Así, teniendo en cuenta los esfuerzos previos del grupo de investigación en el que se ha desarrollado este trabajo para identificar QTL que influyen sobre la resistencia a los nematodos gastrointestinales (NGI)s en ovejas de raza Churra utilizando un barrido genómico con microsatélites, el objetivo inicial de este proyecto de tesis consistió en utilizar el Illumina OvineSNP50 BeadChip (el chip de 50K-SNP) para replicar algunos de los QTL anteriormente descritos en la raza Churra para caracteres indicadores de resistencia a NGIs, y si fuera posible, redefinir su intervalo de confianza e identificar nuevos QTL que influyen sobre este carácter complejo en esta población comercial de ovino lechero. Con ese propósito, se utilizó el chip de 50K-SNP, desarrollado por el Consorcio Internacional para la Genómica de la Oveja, y comercializado por Illumina en 2009, con el fin de realizar una scaneo del genoma ovino para identificar QTL con influencia sobre la resistencia a los parásitos en la oveja Churra. Este estudio incluyó 14 familias de medio hermanas de una población comercial de raza Churra que fueron genotipadas con el chip de 50K-SNP y muestradas para dos caracteres indicadores de la resistencia a NGI: el recuento de huevos en heces (Faecal egg Count o FEC) y los niveles séricos de IgA. Los datos de los genotipos y fenotipos fueron analizados usando el clásico análisis de ligamiento (LA), un análisis de desequilibrio de ligamiento combinado con análisis de ligamiento (LDLA) y un estudio de asociación del genoma completo (GWAS). Utilizando estos tres tipos de análisis, que pueden detectar asociaciones significativas con diferentes características, hemos tratado de presentar una visión global de los loci que influyen sobre la resistencia a los NGI en esta población comercial de ovejas, complementando las limitaciones del clásico LA con las aproximaciones alternativas de LDLA y GWAS, que aprovechan información a nivel poblacional. A parte de algunos análisis preliminares, presentados en diferentes conferencias, considerando inicialmente el orden y las posiciones de los marcadores SNPs analizados según la versión 2.0 del Genoma Ovino, o analizando solamente uno de los indicadores estudiados, los tres barridos genómicos realizados (LA, LDLA y GWAS), basados en la versión 3.1 del Genoma Ovino, identificaron un total de 76 regiones genómicas significativamente asociadas con los dos fenotipos en este studio (FEC e IgA). Para el indicador FEC el análisis LA reveló dos regiones genómicas detectadas previamente en OAR6 y 8, y para IgA se detectó una sola región significativa en OAR22. El barrido genómico con LDLA identificó un total de 63 regiones significativas (de las cuales 30 mostraron efectos sobre FEC y 33 sobre IgA). Finalmente, el análisis GWAS detectó 10 SNPs significativos, distribuidos en varios cromosomas, significativamente asociados con el indicador IgA. Es de interés que, según la versión actual del genoma ovino (Oar_v3.1), el QTL para el carácter FEC detectado en OAR6 mediante LA (80,8-91,4 Mb) se solapa con el QTL más significativo descrito anteriormente por nuestro grupo en la población de Churra analizada en el barrido genómico basado en microsatélites, en la región 68-85,1 Mb de OAR6). Además, en OAR6, los resultados LDLA para FEC revelaron tres regiones genómicas significantivas, una alcanzó el nivel de significación genome-wise en la posicion 72,5 cM y las otras dos asociaciones significativas a nivel chromosome-wise en las posiciones 36 y 89,9 cM. La última de estas asociaciones significativas del scan LDLA está incluida dentro del intervalo de confianza (IC) del QTL detectado por LA en ese cromosoma; por tanto, los resultados del análisis LDLA también apoyan la replicación del QTL descrito anteriormente en esta región por nuestro grupo. A nivel metodológico, el barrido genómico LDLA identificó más resultados significativos que los análisis basados en LA y GWAS. Por lo tanto, considerando la estructura familiar de la población aquí estudiada, la aproximación LDLA presenta mayor precisión para mapear QTL que LA, conservando su robustez frente a la detección de asociaciones espurias. Además, el análisis LDLA parece sufrir menos los efectos de la corrección de múltiples test que el método GWAS, por lo que el LDLA proporcionaría una potencia mayor para detectar verdaderos QTL. Basándonos en los resultados obtenidos en nuestro trabajo, la comparacion con QTL descritos por otros autores y las diferencias conocidas sobre los mecanismos inmunes en animales jóvenes y adultos, hemos propuesto que el QTL replicado en OAR6 podría estar relacionado con mecanismos inmunes específicamente activados en animales adultos durante la exposición al parásito. Sin embargo, dada la complejidad de la respuesta inmune contra las infecciones por helmintos, se necesitan futuros estudios para llegar a identificar la mutacion causal de este QTL replicado en oveja Churra. Como extensión del objetivo inicial planteado en la presente tesis doctoral, surgen sendas colaboraciones científicas con otros dos grupos de trabajo que participan en el proyecto Europeo NTI del NematodeSystemHealth relacionado con esta tesis doctoral: i) el estudio de la variabilidad genética de dos genes de clase IIB del Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) en los machos de raza Churra cabeza de pedigrí de la población ovina estudiada en el estudio de mapeo de QTL descrito previamente, y ii) la determinación de la prevalencia de infecciones por NGI en ovejas adultas sometidas a una infección natural aunque con bajas cargas parasitarias, mediante la combinación de la información de los dos caracteres indicadores utilizados en este estudio; para esto último aplicamos un modelo binomial negativo de ceros inflados (ZINB) a los datos del carácter FEC y posteriormente, el modelo se extendió para incluir la información de los datos de la respuesta de IgA, a fin de discriminar qué animales estaban infectados y cuáles no habían sido expuestos o lo habían sido pero con un nivel muy bajo de infección. Con relación al segundo objetivo propuesto, nuestro estudio de variabilidad ha identificado en el gen DRB1 nueve alelos conocidos y tres nuevos, así como diez alelos conocidos y quince nuevos alelos en el gen DQB en los 15 machos de raza Churra analizados. En base a la variabilidad de los genes de clase IIB del MHC en las muestras analizadas fuimos capaces de identificar 14 haplotipos. A pesar del limitado número de animales analizado en este estudio, los resultados han demostrado que es posible desarrollar un sistema de genotipado de estos genes eficiente para esta población, lo cual podría ser de interés para futuros estudios en este tema que involucren un mayor número de individuos de la raza Churra española. En la actualidad, el cambio climático está adquiriendo una creciente importancia en cuanto a la presencia y el impacto de las enfermedades parasitarias. La prevalencia de las infecciones por NGI en los animales infectados de forma natural se ve afectada por las condiciones ambientales que influyen directamente sobre la viabilidad de las fases de vida libre de los parásitos en el medio ambiente, y por lo tanto sobre la fase infectantes. En el desarrollo de la presente tesis doctoral se observó que las condiciones climáticas adversas tuvieron un importante efecto sobre el desarrollo de las fases parasitarias de vida libre en el pasto. En este sentido se observó que un elevado número de los animales en pastoreo muestreados para el estudio del QTL tuvieron cero como valor de FEC (64%). Los estudios anteriores sobre las infecciones por NGI realizados en la misma zona geográfica de León mostraron una mayor prevalencia de la infección. Ante esta situación, el tercer objetivo de esta tesis doctoral se plantea con el fin de estudiar de una forma concreta los caracteres indicadores de resistencia bajo condiciones de niveles muy bajos de infección. Por lo tanto, para los animales con datos de FEC igual a cero, hemos desarrollado un nuevo método que discrimina entre ovejas que no habían sido infectadas y aquellas infectadas pero con cargas parasitarias muy bajas. A tal fin, se aplicó un modelo ZINB para calcular el grado de inflación de ceros del carácter indicador FEC; posteriormente este modelo ZINB se extendió para incluir la información de las respuestas del carácter IgA. En relación a nuestra base de datos, este modelo ZINB extendido sugirió que el 38% de las ovejas muestreadas no estuvo expuesto a la infección por NGI. Después, se utilizó el sub-conjunto de datos que incluía los animales que se consideraron como expuestos a la infección por nematodos, un total de 328, para calcular las correlaciones entre los caracteres estudiados. Encontramos una correlación cercana a cero entre FEC e IgA y una correlación positiva significativa entre la IgA y Piexp(probabilida stimada de estar expuesto a la infección). Los resultados de este trabajo indican que además de los datos de FEC, la evaluación del nivel de IgA en el suero puede ser un método útil en el control de las infecciones por NGI en rebaños de animales adultos con bajo nivel de infección, lo que podría ser de gran importancia para la planificación de estrategias de selección encaminadas a mejorar la resistencia de las poblaciones ovinas a estas infecciones.