Desarrollo y optimización de andamiajes tridimensionales para el cultivo de células de la conjuntiva

Abstract

La reconstrucción de la superficie ocular, por ingeniería tisular, representa una modalidad terapéutica con grandes perspectivas. La restauración de la conjuntiva constituye una parte esencial en la regeneración de la superficie ocular, especialmente cuando un área extensa o toda la superficie ocular se ve afectada, como ocurre en pacientes con penfigoide ocular cicatricial, síndrome de Stevens-Johnson, necrolisis epidérmica tóxica, o quemaduras térmicas y químicas. El presente trabajo, para desarrollar un modelo in vitro de conjuntiva, está dividido en tres capítulos correspondiéndose cada capítulo con cada objetivo específico desarrollado, puesto que las conclusiones establecidas en cada capítulo han servido como base para el planteamiento del siguiente objetivo. Las muestras de conjuntiva para la realización de este estudio han sido de origen porcino. En el primer capítulo, se ha conseguido optimizar un protocolo de digestión basado en la acción secuencial de dos enzimas: colagenasa tipo I y solución Tripsina/EDTA, para la obtención de células estromales y células epiteliales, respectivamente. Mediante inmunofluorescencia se ha comprobado que los componentes celulares aislados mantuvieron sus características fenotípicas durante el proceso de expansión in vitro. Se ha definido la zona bulbar de la conjuntiva como la localización anatómica para la extracción de biopsias, porque las células epiteliales aisladas tienen capacidad de sintetizar mucinas. En el segundo capítulo de este trabajo se han diseñado hidrogeles de fibrina, denominados andamiajes tridimensionales de primera generación, utilizando como biomaterial biológico la fibrina procedente de plasma fresco y de crioprecipitado de plasma fresco. Se han cultivado en su interior células estromales y en su superficie células epiteliales. Los estudios realizados a las dos semanas de cultivo mediante técnicas de histología, así como microscopía electrónica de barrido, mostraron una correcta adhesión y distribución de las células estromales en el interior de los andamiajes y la estratificación de las células epiteliales en la superficie. También se ha determinado la composición bioquímica de los sustitutivos conjuntivales resultantes. Por último, en el tercer capítulo de este trabajo se ha aplicado un protocolo de descelularización para la obtención de conjuntiva acelular. Los estudios microestructurales, de viabilidad celular, biomecánicos, bioquímicos y de citotoxicidad permitieron caracterizar la conjuntiva acelular resultante que se ha utilizado como material biológico de partida en el diseño de sustitutivos conjuntivales. Como segunda generación de andamiajes se ha utilizado la conjuntiva porcina descelularizada. Para la tercera generación de andamiajes tridimensionales se ha elaborado una formulación innovadora utilizando como base la fibrina y las fibras obtenidas de la digestión de la conjuntiva porcina descelularizada. En ambos andamiajes, se han cultivado simultáneamente los dos tipos celulares de la conjuntiva: en la segunda generación, las células estromales se inyectaron en el interior de la conjuntiva y en la tercera generación se combinaron con fibrina y con fibras de conjuntiva descelularizada; las células epiteliales se cultivaron sobre la superficie. Los estudios realizados a las dos semanas de cultivo mediante técnicas de histología, así como microscopía electrónica de barrido, mostraron la estratificación de células epiteliales en la superficie y una correcta adhesión y distribución de las células estromales en el interior de los andamiajes. En los sustitutivos conjuntivales resultantes se ha determinado la composición bioquímica. En conclusión, los resultados de nuestro estudio han demostrado que la aplicación de las técnicas de cultivo celular y de ingeniería tisular, han permitido generar un equivalente de la conjuntiva del cerdo, estructuralmente análogo a la conjuntiva nativa de este animal, utilizando diferentes andamiajes tridimensionales biológicos.