Los transposones "Tan 1 y Vader" de "Aspergillus awamori" ATCC 22342"diseño de un sistema de mutagénesis y caracterización del mismo en el género "Aspergillus"

Resumo

En esta Memoria se describe el desarrollo de un sistema de mutagénesis "dirigida" estable empleando el sistema transposicional formado por el tranposón Tan1 y por el elemento movil Vader de Aspergillus awamori ATCC 22342. Ambos forman un sistema único, en el cual Tan1 actúa proporcionando la transposasa capaz de movilizar a Vader. Esta característica, junto con el funcionamiento propuesto del sistema descrito en la patente americana 5.985.570, han sido las empleadas en la elaboración del sistema de mutagénesis descrito en esta Memoria. A partir de este funcionamiento observado se desarrollaron todas las construcciones descritas en esta Memoria, primero mediante un sistema "doble" de transposición en el cual los elementos "Vader" y Tan1 estarían incluidos en dos plásmidos distintos. En este proceso, se emplearía la resistencia a fleomicina primero y a higromicina después. La funcionalidad de este sistema se demostró realizando la interrupción del gen pyrG en A. niger y del gen yA en A. nidulans. Posteriormente, con el vector pIRFN, se llevó a cabo la elaboración de un sistema transposicional "único" con el empleo del gen ble de resistencia a fleomicina como único marcador de selección. Mediante esta construcción, fueron obtenidos mutantes del gen wA en A. nidulans. El gen hph que confiere resistencia a higromicina B, se usó en la construcción del vector pHVFN con el que se elaboraron los plásmidos pHVT2-R y pHVT2-F. Con estas construcciones, se logró la interrupción del gen tan1, evitando así que el elemento Vader siguiese transponiéndose sin control y estabilizando el genotipo mutante obtenido ya que en las cepas fúngicas empleadas en las transformaciones se comprobó previamente la ausencia de los tranposones descritos en esta Memoria. Por lo tanto, se ha logrado obtener un sistema de mutagénesis funcional y estable con los elementos descritos dentro del género Aspergillus, alcanzándose así el objetivo principal propuesto en est