Daño en el genoma paterno y reparación embrionaria en pecesefectos en la descendencia

Zusammenfassung

La presente tesis doctoral estudia el efecto en la cromatina paterna sobre el desarrollo embrionario en la trucha. El primer capítulo, que está constituido por dos trabajos, aborda el estudio de los efecto del daño genotóxico en muestras seminales de trucha (O. mykiss) sobre el desarrollo de la progenie. Se lleva a cabo un análisis masivo de la expresión de genes en larvas obtenidas con semen portador de diferente nivel de daño en su cromatina debido al uso de protocolos de criopreservación no óptimos. Además, la mitad de las progenies fueron incubadas en condiciones estándar, y la otra mitad fueron sometidas a la inhibición de la reparación durante la primera división zigótica. Los resultados revelaron un gran número de genes diferencialmente expresados (DEGs) en las larvas procedentes de embriones cuya reparación zigótica fue inhibida. Estos DEGs estaban fundamentalmente relacionados con las rutas de reparación del ADN, el control del ciclo celular y la apoptosis, revelando un patrón diferente de respuesta al daño en el ADN que las larvas control. Los transcritos implicados en actividad apoptótica mostraban una función antagonista, ya que genes pro-apoptóticos estaban reprimidos y los anti-apoptóticos estaban sobre- expresados a pesar de la inestabilidad genómica provocada en el embrión. Dichos resultados sugerían que las larvas supervivientes eran las que habían adquirido una respuesta de tolerancia al daño genotóxico, provocado a partir de la primera división del embrión. Además, se ha constatado que es esencial un control exhaustivo de la integridad del ADN espermático tras procesos de congelación/descongelación. Así, lesiones en la cromatina espermática causadas por la criopreservación, provocaron diferencias significativas en el perfil transcriptómico de las larvas obtenidas con semen fresco y criopreservado, que afectaban a procesos metabólicos que pueden ser clave para su futuro crecimiento y desarrollo. En el segundo capítulo quisimos determinar si los factores de manejo de reproductores que se aplican en piscifactorías, en concreto la manipulación del periodo natural de puesta, pueden afectar a la maquinaria de reparación del ADN de los ovocitos, y tener un impacto negativo en el desarrollo de la progenie, especialmente cuando el genoma paterno está dañado. Para ello evaluamos el efecto del cambio de fotoperiodo, y por tanto del régimen térmico en el que ocurre la gametogénesis, en la calidad de los gametos de trucha arcoiris (O. mykiss). Mediante una técnica de PCR a tiempo real (qPCR) pudimos confirmar las lesiones promovidas en el semen, así como la disminuida capacidad reparadora de los ovocitos obtenidos en regímenes térmicos inapropiados. Demostramos que, en estadios tempranos de desarrollo, los embriones obtenidos fuera del periodo natural de puesta poseen una intensa capacidad reparadora, pero una reducida capacidad para detener el desarrollo y reparar el daño en el ADN, perfil similar al de los ovocitos de los que proceden. La actividad apoptótica en estas mismas progenies se vio reducida durante la organogénesis, momento clave en el desarrollo normal de los órganos. La tolerancia al daño observada suprimió la inducción de la apoptosis, permitiendo progresar con el desarrollo en condiciones ambientales de estrés, que finalmente promovió una alta tasa de larvas malformadas que llegaron a la eclosión, pero no fueron capaces de sobrevivir a largo plazo. La respuesta al daño en el ADN (DDR) es un mecanismo altamente conservado y coordinado de señalización que, tras la detección de la lesión en el ADN, activará alguna de las diferentes vías de reparación. El proceso se verá facilitado por la activación de un mecanismo de parada del ciclo celular para dar tiempo suficiente a estos mecanismos de reparación a eliminar el daño. De este modo se consigue evitar que las lesiones se transmitan a las células hijas. En el caso en el que el daño sea demasiado severo, los factores que regulan ésta respuesta al daño se encargarán de eliminar la célula dañada por un mecanismo de apoptosis o senescencia. Los peces comparten con los mamíferos muchos de los mecanismos implicados en la DDR y, aunque se ha observado la activación de diversas vías de reparación en embriones de pez cebra, poco se sabe sobre la respuesta al daño durante el desarrollo embrionario. Nuestros resultados previos mostraban una alta tolerancia de los embriones a la inestabilidad genética y por ello, en el tercer capítulo, quisimos abordar más en profundidad qué ocurre en los primeros estadios de desarrollo embrionario. En este estudio usamos el pez cebra (D. rerio) como especie modelo para analizar los efectos del fecundación con semen portador de daños genotóxicos severos, causados por irradiación UV, en la activación de mecanismos de respuesta al daño, así como en el desarrollo de la progenie. Demostramos que espermatozoides con un alto nivel de fragmentación, superior al 10%, fueron capaces de fecundar el ovocito. Mediante técnicas de inmunodetección localizamos y cuantificamos la presencia de γH2AX y 53BP1, principales marcadores moleculares de daño y reparación, confirmando una alta actividad de reparación durante la activación transcripcional del zigoto, en aquellos embriones obtenidos con semen portador de daño genotóxico. Además, el análisis de la actividad transcripcional (medante qPCR) y postraduccional (mediante inmunodetección) de p53 reveló una sobre-expresión del gen y altos niveles de activación de la proteína a lo largo del desarrollo embrionario, demostrando una fuerte activación de los mecanismos de respuesta al daño. La activación de p53 promueve su función transcripcional, pudiendo activar vías de parada del ciclo celular, de reparación o de apoptosis. En este sentido, una vez que p53 está activado y estabilizado, se une a la región promotora de numerosos factores pro-apoptoticos en la ruta de muerte celular mitocondrial. Sin embargo, en nuestro estudio, en aquellas progenies obtenidas con semen dañado, los genes pro-apoptóticos mostraron menores niveles de expresión, mientras que los factores anti-apoptóticos revelaron una sobre-expresión, dando lugar a un escenario de represión apoptótica a pesar de la clara inestabilidad genómica presente en el embrión y sugiriendo una tolerancia al daño. Los resultados fueron confirmados tras observar una menor tasa de apoptosis revelada por el estudio con Anexina V. Esta tolerancia al daño en el genoma del embrión promovió tal inestabilidad genómica, que disminuyo prácticamente a la mitad la supervivencia de las larvas obtenidas con semen dañado respecto a las progenies control. Además la gran mayoría mostraron un cúmulo de malformaciones, que fueron incompatibles con la supervivencia a largo plazo. En este último trabajo, demostramos la activación de una fuerte respuesta al daño genotóxico, que implica a p53, pero que se resuelve con la tolerancia al daño. Se ha descrito recientemente en células de mamífero irradiadas con UV, un mecanismo en el que las lesiones del ADN evaden su detección y progresan con la replicación gracias a la cooperación de p53 con polimerasas específicas. La respuesta observada en pez cebra podría deberse a la activación de un mecanismo similar o representar una ruta específica de respuesta al daño en peces, ya que, al menos en pez cebra, se ha descrito la presencia de una isoforma alternativa (Δ113p53), que modifica la expresión de genes regulada por p53 y antagoniza la apoptosis. La tolerancia celular al daño en el ADN podría ser un mecanismo evolutivo propio de los animales con una estrategia reproductiva basada en la producción de un gran número de descendientes con una baja tasa de supervivencia a largo plazo. La tolerancia a la mutagénesis, favorecería la supervivencia de individuos que en otros grupos de vertebrados no superarían la fase embrionaria, y que podrían mostrar ventajas de adaptación a condiciones ambientales cambiantes.