Contribuciones al cultivo, la selección de sexo y la supervivencia a la criopreservación de embriones bovinos producidos in vitro

Abstract

El presente trabajo de Tesis Doctoral aborda 4 ensayos experimentales cuyo principal objetivo ha sido la mejora del rendimiento de la técnica de producción de embriones bovinos in vitro a través de la adición de citoquinas al medio de cultivo embrionario, la utilización del semen sexado para la fecundación y la mejora de los porcentajes de supervivencia a la criopreservación de embriones bovinos producidos in vitro. En el primer trabajo, se valoró el efecto de la adición de activina (citoquina englobada en la familia factor de crecimiento transformante) al medio de cultivo de embriones producidos in vitro sobre la capacidad de desarrollo embrionario, la proliferación y diferenciación celular y los índices de apoptosis/necrosis. La adición de activina al cultivo in vitro se realizó de forma secuencial; la calidad embrionaria fue evaluada en función del número de células en la masa celular interna y en trofectodermo, y de los índices de apoptosis y necrosis en día 8. La presencia de activina en cultivo de día 1 a día 3, repercutió negativamente en las tasas de desarrollo embrionario. Sin embargo, cuando la suplementación se realizó a partir del estadio de mórula (día 5), las tasas de blastocistos en día 7 y 8 se vieron incrementadas. Cuando la citoquina estuvo presente desde día 3 hasta el final del cultivo (día 8), se observó una disminución de las células del trofectodermo. Los índices de apoptosis aumentaron cuando la activina se suplementó en periodos del cultivo posteriores a día 3. En el segundo trabajo, se analizó la capacidad de desarrollo embrionario, la supervivencia a la vitrificación y la fertilidad de embriones producidos in vitro con semen sexado. Los embriones producidos con semen sexado presentaron una capacidad de desarrollo menor que los producidos con semen completo. Esta disminución en su capacidad de desarrollo no se vio modificada por el uso de diferentes sistemas de cultivo. Los índices de supervivencia a la vitrificación (re¿expansión y eclosión a 24 y 48 horas) de los embriones producidos con semen sexado fueron comparables a los obtenidos con sus respectivos controles no sexados. Los embriones frescos producidos con semen sexado y posteriormente transferidos a hembras receptoras presentaron similares índices de gestación que sus homólogos vitrificados/calentados. El tercer trabajo permitió la puesta a punto de un protocolo de determinación de sexo en blastocistos mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Inicialmente se abordó la optimización del proceso de digestión de ADN embrionario mediante choque térmico y posteriormente se acometió la amplificación. A diferencia de la amelogenina, que incorpora un único par de primers como control interno, el uso de primers independientes para el cromosoma X e Y (BRY4a/SAT) dio lugar a errores en el diagnóstico del sexo. En el último experimento, se analizó el efecto de la aplicación de una presión hidrostática subletal sobre la supervivencia a la vitrificación de blastocistos bovinos producidos in vitro. El tratamiento de presión no influyó en la resistencia a la vitrificación de embriones; sin embargo, entre embriones tratados, el número de células de la masa celular interna de los que eclosionaron a las 48 horas post¿calentamiento fue superior al del resto de grupos analizados, resultado que sugiere una mayor calidad embrionaria.