NAD-glutamato deshidrogenasa de Haloferax mediterraneiclonaje, secuenciación y expresión. Purificación y propiedades de la enzima nativa y recombinante

Abstract

Haloferax mediterranei es un organismo halófilo extremo perteneciente al Dominio Archaea y que presenta diferentes actividades glutamato deshidrogenasa, enzima que cataliza la interconversión entre catabolitos tan importantes como el 2-oxoglutarato y el L-glutamato. Una de ellas, la NADP-dependiente, presenta un máximo de actividad a 2 M de NaCl y 1 M de KCl, siendo ligeramente mayor en presencia de KCl que en NaCl. También se ha determinado actividad glutamato deshidrogenasa NAD-dependiente, con la que se han realizado estudios de purificación y caracterización, así como el clonaje, secuenciación y expresión de su gen. Con la finalidad de obtener enzima en concentraciones elevadas que permitiesen realizar estudios de cristalización, el gen de la NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, se expresó en el huésped mesófilo E. coli, obteniéndose la proteína en forma de agregados insolubles. La renaturalización de la NAD-glutamato deshidrogenasa recombinante se llevó a cabo mediante dilución rápida empleando tampones con una elevada concentración de sal, siendo ésta óptima a 4 M de NaCl. Se purificó y caracterizó la NAD-glutamato deshidrogenasa nativa observando que las propiedades moleculares y cinéticas determinadas para esta enzima son prácticamente idénticas a las obtenidas para la enzima recombinante. La NAD-glutamato deshidrogenasa de Hfx. mediterranei, es un homohexámero con un tamaño de subunidad de aproximadamente 48 kDa y una masa molecular de 290 kDa. La enzima presenta un comportamiento halofílico y también cierto carácter termofílico, con un máximo de actividad a 4 M de NaCl y una temperatura óptima de 60 ºC. Además el análisis peptídico realizado mediante la técnica de Nanoelectrospray LC/MS, permite la confirmación de forma inequívoca de la identidad de la enzima nativa con la enzima obtenida mediante clonaje, secuenciación y expresión.El análisis comparativo