Identification of tick saliva antigens as vaccine candidates and immunotherapeutics

Resumen

Mice are widely used in research. This animal species has also beenextensively used to study the relationship between ticks and their mammalian hosts,including the design and test of vaccine candidates, although it is believed that mice donot develop tick immunity. We have established a test system in order to assess protectionagainst tick feeding using this small animal model. We have redesigned containmentcapsules and tested the use of tissue cement to attach them to the shaved skin of the mice.Our results provide both an improved capsule design and permanent and strong bondingcapabilities of the tissue cement. We then assessed the protective capacity of differentimmunization strategies, both active and passive, against an array of antigens and tissueextracts. We therefore tested active immunization with tick Histamine Release Factor(tHRF), as well as passive transfer of both human and bovine sera against whole tick,midgut or salivary gland extracts. We found that none of the strategies utilized elicitedstrong and consistent effects on different parameters of tick feeding, such as attachmenttime, weight at detachment or molting efficiency. These results suggest that, at least forthe European tick, Ixodes ricinus, mice are not in general a suitable model to test anti-tickvaccines.On the other hand, in order to identify tick antigens as potential targets for thedevelopment of a tick vaccine, salivary gland and midgut extracts wereimmunoprecipitated with immune antisera raised in cows that had shown protectiveeffects against tick feeding in these animals. We identified antigen with putativemetalloprotease, integrin and Apple domain-containing proteins that could function toprevent blood coagulation. Our identification was validated with the protein annotated asI. ricinus A0A0K8RQF1, which shares homology with Toll-like receptors and could formpart of the immune response of ticks. This antigen, which is differentially recognized byprotective anti-tick sera could alone or in combination protect against tick feeding inspecies such as cows and perhaps humans, and provide the basis for a new anti-tickvaccine.Salp15, a salivary protein of Ixodes ticks, inhibits the activation of naïve CD4 Tcells. Treatment with Salp15 results in the inhibition of early signaling events and thexxx viproduction of the autocrine growth factor, interleukin-2. The fate of the CD4 T cellsactivated in the presence of Salp15 or its long-term effects are, however, unknown. Wenow show that Salp15 binding to CD4 is persistent and induces a long-lastingimmunomodulatory effect. The activity of Salp15 results in sustained diminished crossantigenicantibody production even after interruption of the treatment with the protein.Transcriptionally, the salivary protein provokes an acute effect that includes knownactivation markers, such as Il2 or Cd44, and that fades over time. The long-term effectsexerted by Salp15 do not involve the induction of either anergy traits nor increasedpopulations of regulatory T cells. Similarly, the treatment with Salp15 does not result in Bcell anergy or the generation of myeloid suppressor cells. However, Salp15 induces theincreased expression of the ectoenzyme, CD73, in regulatory T cells and increasedproduction of adenosine. Our study provides a profound characterization of theimmunomodulatory activity of Salp15 and suggest that its long-term effects are due to thespecific regulation of CD73.xxxviiRESUMENEl modelo de ratón ha sido ampliamente usado en investigación. Esta especieanimal ha sido también ampliamente usada para estudiar las relaciones entre lasgarrapatas y sus huéspedes mamíferos, incluyendo el diseño y evaluación de antígenospara el desarrollo de vacunas, a pesar de la creencia de que los ratones no desarrollaninmunidad frente a garrapatas. En nuestro grupo, hemos establecido un sistema con el finde poder evaluar la protección frente a la alimentación de las garrapatas usando estemodelo animal. Hemos rediseñado capsulas de contención y puesto a prueba el uso depegamento tisular para fijar las capsulas a la piel del ratón. Nuestros resultadosproporcionan tanto un diseño mejorado de la capsula de contención como una fuertecapacidad de adhesión y duración por parte del pegamento tisular. De esta manera,evaluamos la capacidad protectora de las diferentes estrategias de inmunización, tantoactiva como pasiva, frente a una variedad de antígenos y extractos tisulares de garrapata.Asimismo, evaluamos la inmunización activa con el Factor de Liberación de Histamina,así como la transferencia pasiva de sueros tanto humanos como bovinos frente a extractosde garrapata total, estomago o glándula salivar. Los resultados mostraron que ninguna delas estrategias utilizadas provocó efectos sólidos y consistentes en cuanto a parámetrosrelacionados con la alimentación de garrapatas, tales como el tiempo de adhesión alhuésped, el peso a la hora de su desprendimiento o la eficiencia en la muda. Estosresultados sugieren que, al menos para la garrapata europea, Ixodes ricinus, el modelo deratón no es un modelo apropiado para el diseño y estudio de vacunas anti-garrapatas.Por otra parte, con el fin de identificar antígenos de garrapatas como dianaspotenciales para el desarrollo de una vacuna, extractos de glándula salivar y estómagofueron inmunoprecipitados con suero inmune elaborado en vacas que previamentemostraron efectos protectores frente a su alimentación en estos animales. De esta forma,identificamos antígenos tales como metaloproteasas, integrinas y proteínas con dominiosApple que podrían actuar previniendo la coagulación de la sangre. Nuestra identificaciónfue validada con la proteína anotada como I. ricinus A0A0K8RQF1, que compartehomología con los receptores Toll y podría formar parte de la respuesta inmune de lasgarrapatas. Este antígeno, diferencialmente reconocido por el suero inmune contragarrapatas, podría, o bien sólo o bien en combinación con otros antígenos, proteger contraxxx viiila alimentación de garrapatas en especies tales como vacas y tal vez humanos, yproporcionar, a su vez, la base para una nueva vacuna frente a estos parásitos.Salp15, una proteína de la saliva de garrapatas del genero Ixodes, inhibe laactivación de las células CD4 T. El tratamiento con Salp15 resulta en la inhibición deeventos de señalización celular tempranos y de la producción del factor de crecimientoautocrino, interleuquina-2. El destino de las células CD4 T activadas en presencia deSalp15 o sus efectoras a largo plazo son, sin embargo, desconocidos. En este estudiomostramos que la unión de Salp15 a CD4 es persistente e induce un efectoinmunomodulatorio de larga duración. La actividad de Salp15 provoca una producciónreducida de anticuerpos frente a antígenos cruzados que es prolongado en el tiempo,incluso después de la interrupción del tratamiento con Salp15. A nivel transcripcional,la proteína salivar provoca un efecto agudo en la transcripción de varios genes queincluyen marcadores de activación, tales como Il2 o Cd44, y que se desvanece con eltiempo. Los efectos a largo plazo ejercidos por Salp15 no involucran la inducción demarcadores de anergia ni el aumento de la población de células T reguladoras.Similarmente, el tratamiento con Salp15 no resulta en la generación de células Banergicas o de células mieloides supresoras. Sin embargo, Salp15 induce unincremento en la expresión de la ectoenzima, CD73, en las células T reguladoras y unaumento en la producción de adenosina. Nuestro estudio proporciona unacaracterización profunda de la actividad inmunomodulatoria de Salp15 y sugiere quesu efecto a largo plazo es debido a la regulación específica de CD73.