Relación estructura-función en la interacción entre proteínas G y bicapas lipídicas

Resumen

Las proteínas G heterotriméricas constituyen complejos de señalización claves para la propagación de señales del exterior al interior de las células. Un mensajero primario cuya naturaleza puede ser muy diversa (proteína, péptido, pequeño neurotransmisor, iones, fotones...) estimula un receptor de membrana heptahelicoidal acoplado a proteína G. Su activación produce un cambio conformacional en la proteína G que se halla acoplada al receptor, que a su vez se activa. Entonces, la subunidad G intercambia GDP por GTP y se disocia del dímero G. El receptor, que permacece activado, puede recibir otras proteínas G de forma secuencial y activarlas. Para ello, las proteínas G están en exceso molar respecto a los receptores que las activan, lo cual conduce a una considerable amplificación de la señal. Las proteínas G heterotriméricas están constituídas por tres subunidades: , y . Hasta la fecha hay descritas en la especie humana 16 variantes de la subunidad , 6 de la subunidad y 12 de la (Escribá et al, 2007; Dupré et al, 2009). Tras la activación del complejo heterotrimérico, la subunidad por un lado, y el dímero G por otro, se dirigen hacia sus respectivas proteínas efectoras, modulando positiva o negativamente su actividad. Las subunidades pueden incorporar en su extremo amino-terminal los ácidos grasos mirístico y/o palmítico, mientras que las subunidades pueden verse modificadas en su extremo carboxi-terminal por los lípidos isoprenoides farnesilo o geranilgeranilo. Un evento crítico para la propagación del mensaje por parte de las proteínas G es su anclaje a la membrana plasmática. Este fenómeno tiene lugar a través de los puntos de las proteínas G donde ocurre la unión covalente de lípidos a las proteínas. Se sabe que el complejo Gi112 es capaz de incorporar los ácidos grasos mirístico y palmítico, que irían unidos a la proteína Gi1, y el lípido geranilgeranilo, unido a la subunidad G2. Dado que cada tipo de proteína G puede acoplarse con varios tipos de receptores (y viceversa) la localización subcelular de dichas proteínas en determinados microdominios de membrana influye en la señalización celular. Éste fue el complejo multiproteico elegido como modelo de estudio en esta Tesis Doctoral, con el objetivo de determinar el papel que los lípidos de las proteínas G, y determinados dominios adyacentes, juegan en las decisivas interacciones proteína-lípido. También se trató de comprender el efecto que diferentes lípidos, representativos de distintos dominios lipídicos de las membranas biológicas, tienen en dichas interacciones. Los resultados expuestos en este trabajo pusieron de manifiesto la importancia crucial que los lípidos de las proteínas G tienen en la señalización celular, promoviendo por un lado el anclaje de las proteínas G a las membranas biológicas; y, por otro lado, dirigiendo el movimiento de las proteínas G en el plano lateral de dichas membranas, entre microdominios de diferente estructura y composición lipídica. Para llevar a cabo este estudio, se generaron diferentes proteínas Gi1 y G2, mutadas en los puntos en los que se produce la incorporación de los lípidos. También se analizó un pequeño dominio polibásico situado muy próximo al lípido geranilgeraniol de la proteína G2, constituído por tres aminoácidos básicos. Así, también se practicó mutagénesis dirigida contra esos aminoácidos básicos, al efecto de poder determinar su implicación en la interacción de las proteínas G con diferentes microdominios lipídicos. Se comprobó que el ácido mirístico fue decisivo para el anclaje de la proteína Gi1 a membranas lipídicas modelo. Su ausencia provocó la separación casi total de la proteína Gi1 de los distintos tipos de membranas modelo estudiados. Por otro lado, la miristoilación de Gi1 puso de manifiesto la preferencia por microdominios lipídicos ordenados (Lo) ricos en PS de una subunidad Gi1 miristoilada pero no palmitoilada. En cambio, la proteína Gi1 miristoilada y palmitoilada simultáneamente mostró una clara preferencia por microdominios de tipo “raft” pobres en PS. El ácido palmítico es un lípido que se une reversiblemente a la proteína Gi1, con lo que podría dar lugar a importantes cambios conformacionales en la región N-terminal de la proteína que llevarían al distanciamiento o acercamiento de aminoácidos básicos de esa región a la superficie de la membrana plasmática, dependiendo de si dicho ácido graso se halla o no unido a la proteína. En el caso del dímero G12, se observó que también el lípido isoprenoide geranilgeraniol fue esencial, promoviendo la unión de todo el heterodímero a las membranas lipídicas. Su presencia determinó la preferencia del complejo G12 por microdominios lipídicos con alta propensión a adoptar una estructura de tipo no lamelar, y muy especialmente por microdominios ricos en PE y PS. La ausencia del aminoácido cargado positivamente, Lys-64, y sobre todo de los aminoácidos Arg-62 y Lys-65 en la región C-terminal de G2, supuso la pérdida parcial e incluso total de esa mayor unión a los microdominios lipídicos anteriormente citados. Así pues, los aminoácidos básicos próximos al resto geranilgeraniol constituyen determinantes moleculares claves de la interacción con microdominios ricos en lípidos pro-no lamelares. Además, estos aminoácidos se revelaron como los principales responsables de las interacciones de tipo electrostático que se establecen entre el dímero G12 y las bicapas lipídicas. Como ocurriera con Gi1 y con G12, también en el caso del complejo Gi112, el ácido mirístico y el lípido isoprenoide jugaron un papel determinante, conduciendo todos los complejos portadores de estas dos modificaciones hacia microdominios ricos en PE, con alta propensión a adoptar una estructura de tipo no lamelar. El ácido palmítico constituyó, también en el heterotrímero Gi112, un potente regulador de las interacciones proteína-lípido, provocando importantes cambios conformacionales en el complejo multiproteico. Su presencia provocó el desenmascaramiento de aminoácidos aniónicos que, al localizarse próximos a la superficie de la membrana, condicionaron el movimiento de todo el complejo lejos de microdominios de membrana ricos en PS. A diferencia de la proteína Gi1 miristoilada y palmitoilada, el destino preferido del complejo Gi112 miristoilado, palmitoilado e isoprenilado, fueron microdominios lipídicos de estructura pro-no lamelar (es decir, con un empaquetamiento superficial laxo). La ausencia de ácido palmítico unido al complejo multiproteico, determinó una unión preferencial de dicho complejo a microdominios lipídicos ricos en PE y PS, el mismo tipo de dominios a los que se unió mayoritariamente el dímero G12. Se ha visto que también en el caso del heterotrímero sin ácido palmitico unido, los aminoácidos básicos de la región C-terminal de G2, Lys-64, Arg-62 y Lys-65, son determinantes en las interacciones de tipo electrostático que tienen lugar con microdominios lipídicos ricos en PS. Los resultados presentados en este trabajo permiten tener una visión más completa acerca de los mecanismos moleculares implicados en las interacciones de las proteínas G con los lípidos de membrana y, por tanto, en el proceso de transducción de señales. Además, este conocimiento permite diseñar estrategias para regular la señalización basadas en el control de los lípidos de membrana que pueden ser utilizadas con fines terapéuticos.