Respuesta al choque térmico en la bacteria productora de aminoácidos "Corynebacterium glutamicum" ATCC 13032caracterización de promotores inducibles por calor

Resumo

Corynebacterium glutamicum es un microorganismo Gram positivo del suelo con gran capacidad para producir aminoácidos, en el cual no existe un preciso conocimiento genético de los promotores regulados por estrés, y más concretamente por estrés térmico. Para poner a punto las condiciones de análisis de la respuesta al estrés térmico se estudió el crecimiento de C. glutamicum a diferentes temperaturas; además de utilizar como testigo de esta respuesta los genes dnaK y groEL a diferentes tiempos de inducción mediante hibridaciones tipo Northern. Así se caracterizó el patrón transcripcional de estos genes y se definieron las condiciones en las que se alcanza el máximo de expresión a nivel transcripcional (40 minutos a 40ºC). Para observar el efecto de la temperatura a nivel tranduccional se obtuvieron extractos proteicos de C. glutamicum a distintos tiempos de inducción, en los que se observaron tres bandas (95 kDa, 70 kDa y 60 kDa) que incrementan su intensidad con el transcurso de la inducción térmica. Mediante anticuerpos policlonales anti-DnaK y anti-GroEL se identificaron las bandas de 70 y 60 kDa como DnaK y GroEL respectivamente. Así mismo, se constató que en ambos casos tras 60 minutos de inducción estas proteínas alcanzaban su máximo nivel de expresión. Utilizando 40ºC y 60 minutos como condiciones de inducción, se localizaron nuevos genes inducibles por calor a través del análisis del proteoma de C. glutamicum. Así, mediante el uso de elcectroforesis bidimensional se identificaron como inducidas las proteínas: GroEL1, GroEL2, DnaK, ClpB y GrpE las cuales son chaperones moleculares, y PoxB que es una piruvato deshidrogenasa. También se observó como una peptidil-prolil cis-trans isomerasa (PpiA) era reprimida por el aumento de temperatura. En este análisis del proteoma se utilizó la cepa de C. glutamicum ATCC 13032 existente en INBIOTEC y la cepa cuyo genoma fue secuenciado por la compañía D