Funcionalidad biologica de la resistencia a arsenico en la bacteria hipertolerante pseudomonas putida kt240

Resumen

Índice de Figuras 6 Índice de Tablas 9 Abreviaturas 10 Summary 13 I. Introducción 15 1. Resistencia microbiana al arsénico ambiental 17 1.1. Introducción 17 1.2. Bioquímica y especiación de arsénico en el ambiente 19 1.3. Mecanismos de entrada de arsénico en bacterias 21 1.4. Oxidación de arsenito 22 1.5. Respiración anaerobia de arsenato a través de su reducción 22 1.6. Metilación de arsénico 23 1.7. Mecanismos microbianos de tolerancia a arsénico: el operón ars 24 1.7.1. Mecanismos de resistencia a arsénico en P. putida KT2440 26 2. Redundancia genética 28 2.1. Ecoparalogía 29 2.1.1. Origen evolutivo de la ecoparalogía 29 2.2. Transferencia horizontal de genes 30 2.2.1. Transferencia horizontal en P. putidaKT2440 31 3. Fosfinotricina (PPT) y Metionina sulfoximina (MetSox) 31 3.1. Fosfinotricina (PPT) 31 3.1.1. Efectos de la PPT sobre diferentes grupos de microorganismos del suelo 32 3.1.2. Etapasen la degradación de la PPT. PPT N acetiltransferasas. Descripción y anotación errónea 32 3.2. Metionina sulfoximina (MetSox) 34 II. Objetivos 37 III. Materiales y Métodos 41 1. Cepas bacterianas 43 2. Medios y condiciones de cultivo 44 3. Plásmidos 45 4. Transformación de las células 48 5. Transferencia de plásmidos por conjugación 48 1 ÍNDICE 6. Técnicas de manipulación de ADN 48 6.1. Aislamiento de ADN genómico y plasmídico 49 6.2. Diseño de oligonucleótidos 49 6.3. Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR) 52 6.4. Secuenciación de ADN 52 6.5. Construcción de cepas mutantes de P. putida KT2440 52 6.5.1. Construcción de ¿ars1, ¿ars2, ¿phoN1 y ¿phon2 53 6.5.2. Construcción de ¿R1, ¿R2, ¿H1 y ¿H2 55 6.5.3. Construcción de los dobles mutantes ¿ars1¿ars2, ¿phoN1¿phoN2, ¿R1¿R2 y ¿H1¿H2 56 6.5.4. Construcción de los plásmidos pVCl1, pVCl2, pVPPT1, pVPPT2, pVR1, pVR2, pVH1, pVH2 56 6.5.5. Construcción del plásmido pUCP ArsN 57 7. Técnicas de manipulación de ARN 57 7.1. Extracción de ARN 57 7.2. Retrotranscripción seguida de reacción de PCR cuantitativa (RT Q PCR) 58 8. Técnicas de manipulación de proteínas 58 8.1. Obtención de los extractos proteicos para purificación de pMALR1 y pMALR2 58 8.2. Purificación de las proteínas de fusión MBP R1 y MBP R2 59 8.3. Electroforesis en geles de poliacrilamida 59 8.4. Ensayos enzimáticos de ArsH's 60 8.4.1. Obtención de los extractos celulares 60 8.4.2. Ensayos de la actividad oxidoreductasa de las proteínas ArsH1 y ArsH2 de P. putida KT2440 60 8.5. Determinación in vitro de PPTy Nacetil PPT 61 8.6. Ultracentrifugación analítica 61 9. Determinación de Arsénico total intracelular 62 10. Análisis de los datos de secuencia 62