Estudio mediante proteolisis limitada de la estructura de dominios union de ligandos y cambios asociados de conformacion de la carbamil fosfato sintetasa de higado de rata

Resumen

LA CARBAMIL FOSFATO SINTETASA MITOCONDRIAL DE HIGADO DE RATA ES INACTIVADA POR LA ELASTASA CON CINETICA DE PRIMER ORDEN. LA ADICION DE ATP (UNO DE LOS SUSTRATOS) MG ELEVADO 2+ Y ACETILGLUTAMATO (EL ACTIVADOR ALOSTERICO DEL ENZIMA)PROTEGEN COMPLETAMENTE DE ESTA INACTIVACION MIENTRAS QUE EL ACETILGLUTAMATO SOLO ACELERA LA INACTIVACION. MEDIANTE ESTOS CAMBIOS HEMOS DETECTADO LA UNION DEL ACETILGLUTAMATO AL ENZIMA EN AUSENCIA DE OTROS LIGANDOS CON UN K SUB D DE 0.365 MM QUE ES APROXIMADAMENTE 600 VECES MAYOR QUE EN PRESENCIA DE ATP HCO- SUB 3 K+ Y MG ELEVADO A 2+. EL ADP Y EL AMPPNP (UN ANALOGO INERTE DEL ATP)REEMPLAZAN PARCIALMENTE AL ATP EN LA PROTECCION Y POR TANTO LA UNION DEL NUCLEOTIDO SIN POSTERIOR REACCION ES SUFICIENTE PARA PROTEGER. CON OTRAS PROTEASAS LA INACTIVACION TAMBIEN SE ACELERO POR ACETILGLUTAMATO Y SE RETRASO POR MEZCLAS DE ATP MG ELEVADO A 2+ Y ACETILGLUTAMATO INDICANDO QUE ESTOS CAMBIOS DE SUSCEPTIBILIDAD REFLEJAN CAMBIOS EN LA CONFORMACION DEL ENZIMA. ELLO HA SIDO DEMOSTRADO DIRECTAMENTE AQUI UTILIZANDO UNA COMBINACION DE PROTEOLISIS LIMITADA Y DE ELECTROFORESIS. ASI HEMOS ESTABLECIDO QUE LA CARBAMIL FOSFATO SINTETASA (UN UNICO POLIPEPTIDO DE 160 KDA) ESTA CONSTITUIDA POR 4 DOMINIOS COMPACTOS DE 40 43 60 Y 17 KDA EN ESTE ORDEN DESDE EL EXTREMO N-TERMINAL. ESTOS DOMINIOS SON ALTAMENTE RESISTENTES AL ATAQUE PROTEOLITICO Y ESTAN UNIDOS POR 3 SEGMENTOS DE CADENA DESESTRUCTURADA QUE SE EXPONEN AL ATAQUE PROTEOLITICO EN PRESENCIA DE ACETILGLUTAMATO Y DOS DE LOS CUALES SE PROTEGEN CON LA UNION SIMULTANEA DE ATP Y ACETILGLUTAMATO. TAMBIEN DEMOSTRAMOS QUE EL DOMINIO C-TERMINAL DE 17 KDA ES ESENCIAL PARA LA ACTIVIDAD ESTA SUJETO A DRAMATICOS CAMBIOS CONFORMACIONALES Y PROBABLEMENTE PARTICIPA EN EL CENTRO CATALITICO. NUESTROS RESULTADOS SUGIEREN FUERTEMENTE QUE EL ACETILGLUTAMATO SE UNE A ESTE DOMINIO Y TAMBIEN PERMITEN PROPONER LA LOCALIZACION DE LOS PUNTOS DE UNION DE LAS DOS MOLECULAS DE ATP USADAS EN LA REAC