Bases genetico-moleculares de la utilizacion del carbamilfosfato en entercoccus faecalis"

Resumen

En esta tesis se han caracterizado los genes que codifican la via catabólica de la arginina deiminasa en Enterococcus faecalis, microorganismos en el que se descubrió y caracterizó bioquimicamente dicha ruta, que, en tres pasos enzimáticos catalizados por la arginina deiminasa, la ornitina transcarbamilasa catabolica y carbamato quimasa, produce fermentativamente 1 mol de ATP por mol de arginina degradada. El paso clave en la obtención de energia es la transferencia del fosfato desde el carbomilfosfato al ADP, catalizada por la carbamato quinasa. Tras secuenciar un fragmento del cromosomo de E.faecalis de 8228 pb por ambas hebras en pequeños fragmentos solapantes, hemos localizado los genes para estos tres enzimas estrechamente agrupados junto con un gen para el transporte de arginina y un posible regulador transcripcional de la familia CRP-FNR. La identidad de los genes para la arginina deiminasa y la carbamato quinasa ha sido corroborada por sobreexpresion en E.coli, y el de la ornitina trancarbamilasa por comparación de la secuencia predicha con la composicion de aminoacidos conocida de esta proteina y mediante secuenciacion aminoterminal. La implicación del gen para el posible transportador de arginina ha sido corroborada por el analisis del fenotipo de una cepa mutante de E.faecalis, fabricada por nosotros mediante tecnicas de recombinacion homologa, con dicho gen interrumpido por un gen de resistencia a un antibiotico. Estos cinco genes son transcritos en un mensajero policistronico, producido a partir de un unico promotor, como revelan los analisis por Northern blot de extractos de RNA total de E.faecalis y de determinacion de puntos de inicio de la transcripcion. Tambien mediante Northern blot hemos demostrado la induccion del mensajero del operon en cultivos de E.faecalis crecidos en presencia de arginina, y la falta de induccion cuando se añade glucosa el medio. En la region situada aguas arriba del operon, hemos locali