Estudio y caracterización de la aglutamato deshidrogenasa de "Streptomyces clavuligerus"

Resum

En el presente trabajo se ha descrito, por primera vez, una nueva clase de glutamato deshidrogenasas (GDHs). La GDH de Streptomyces clavuligerus ha sido purificada a homogeneidad y se ha caracterizado bioquímica, cinética y genéticamente. Posee una masa molecular nativa (Mr) de 1.100 kDa y está constituida por seis subunidades idénticas (a6) de 183 kDa cada una. Esta GDH, que requiere AMP como activador indispensable, exhibe una máxima velocidad de catálisis en tampón fosfato 100 mM a pH 7 y a 30ºC. En estas condiciones, siguen una cinéica de saturación hiperbólica con el amonio (Km = 33 mM) y sigmoide con el a-cetuglutarato (So,5 =1,3 mM, nh =1,5) y con el NADH (So = 20 uM, nh = 1,5). El aspartato y la asparragina son activadores de los téricos de esta enzima, que además, es inhibida por exceso de los sustratos NADH y NH4+, por algunos intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, por ATP y por Tris. Su función fisiológica parece ser catabólica ya que es específica de NAD+, posee un elevado valor de Km para el amonio y su máxima expresión se obtiene en un medio de crecimiento que contiene glutamato como únicas fuentes de carbono y de nitrógeno. La GDH de S. Clavuligerus es una proteína de 1.651 aminoácidos y está codificada por un fragmento de DNA de 4.953 pb (gen gdh). Exhibe un elevado porcentaje de homología con proteínas codificadas por ORFs, hasta el momento de función desconocida, presentes en el genoma de especies bacterianas de los géneros Mycobacterium, Rickettsia, Pseudomonas, Vibrio, Shewanella y Caulobacter, lo que sugiere que este nuevo tipo de enzimas se encuentra apliamente distribuido entre las bacterias. Además, en este trabajo, se estudian las relaciones filogenéticas entre los diferentes tipos de GDHs y se propone una hipótesis que explica su origen, su evolución y su distribución en los organismos actuales.