Clonación de genes de "Streptomyces" que codifican para enzimas hidrolíticas en corinebacterias productoras de aminoácidos

Laburpena

Hemos podido a obtener la expresión en corinebacterias de genes de Streptomyces y Aspergillus que codifican para enzimas extracelulares no tiene lugar a partir de los promotores endógenos, sino a partir de promotores reconocidos por la maquinaria transcripcional de las corinebacterias, como el promotor del gen de resistencia a kanamicina/neomicina del transposón Tn5, o el promotor del gen cspB de Corynebacterium glutamicum. B.lactofermetum excreta muy pocas proteínas al medio de cultivo, y cuando alguno y dos de los genes de Strptomyces que codifican para enzimas extracelulares (xysA o celA1) se expresan, el producto génico pasa a ser una de las proteínas mayoritarias en el sobrenadante de cultivo. Durante el proceso de secreción de la xilanasa de S.halstedii, B.lactofermentum procesa el péptido señal de la pre-xilanasa de una manera idéntica al Streptomyces productor. Al expresarse los genes estudiados bajo el control del promotor del gen de resistencia a kanamicina, la producción de enzimas extracelulares en B.lactofermentum es constitutiva e independiente de la presencia del sustrato del enzima. El procesamiento de la proteína Xys1L (dominio catalítico + dominio de unión a celulosa) a Xys1S (dominio catalítico) en B.lactofermentum es diferente al procesamiento en Streptomyces. B.lactofermentum no procesa mas del 10% de la proteína Xys1L en 96 h mientras que las cepas de Streptomyces procesan los totalmente Xys1L a Xys1S en 48-84h. La interrupción génica de los ORF4 y ORF5 (dos de las tres ORFs situadas aguas abajo del gen ftsZ y no esenciales para la viabilidad de B.lactofermentum) permiten integrar el gen de la xilanasa, y cualquier otro gen, en el cromosoma de B.lactofermentum, obteniéndose cepas de grado alimentario cuando el segundo proceso de recombinación tiene lugar. El operon melC de Streptomyces glucescens ha sido usado para construir vectores sonda para promotores de corinebacterias, y permite selección p