Construcción de vectores de secreción de hormonas peptídicas en "Streptomyces lividans" JI66

Zusammenfassung

La produccion de proteinas heterologas por parte de hospedadores eucariotas o bacterianos es actualmente uno de los campos mas importantes de la biotecnologia. Esta tesis doctoral aborda este objetivo mediante la estrategia de vectores de secrecion de streptomyces lividans ji66. Como gen "portador" se escogio el de la alfa-amilasa de s. Griseus y como gen heterologo el del factor de liberacion de la corticotropina humana (hcrf). En una primera parte del trabajo se clono, se secuencio y se caracterizo el gen de la alfa-amilasa (amy) de streptomyces griseus en s. Lividans ji66. Como complemento a esta caracterizacion tambien se estudio la expresion del gen amy en escherichia coli como proteina de fusion con la beta-galactosidasa. Posteriormente se optimizo la expresion del gen amy mediante diferentes estrategias: incremento de su tasa transcripcional por reemplazamiento de su promotor por otros de mas eficiente expresion en s. Lividans e incremento de la tasa de secrecion de la alfa-amilasa por introduccion en su peptido "leader", a traves de tecnicas de mutagenesis "in vitro", de inserciones, sustituciones o deleciones de aminoacidos. Por ultimo se realizo la fusion traduccional entre el gen amy y el gen crf en diferentes puntos a lo largo del primero, entre los que se incluyo una fusion traduccional directa justo detras de la zona del dna que codificaba para el peptido "leader" de la proteina alfa-amilasica.